野生桑黄总黄酮提取工艺及其抗氧化作用的研究

李善姬，梁承武，*，崔承弼，金玉姬，白雪松，段　琦（.吉林医药学院，吉林吉林303；.延边大学食品研究中心，吉林延吉3300）

分离提取

野生桑黄总黄酮提取工艺及其抗氧化作用的研究

李善姬1，梁承武1，*，崔承弼2，金玉姬1，白雪松1，段琦1
（1.吉林医药学院，吉林吉林132013；2.延边大学食品研究中心，吉林延吉133002）

摘要：以野生桑黄中的总黄酮提取率为指标，在单因素试验的基础上，选用L9（34）正交试验对总黄酮提取工艺进行优化，并以VC为对照，测定长白山野生桑黄中总黄酮的抗氧化活性。结果表明，正交试验获得的长白山野生桑黄总黄酮提取的最佳工艺为乙醇浓度60%，料液比1∶50（g/mL），超声功率80 W，提取时间40 min。此时总黄酮含量为84.51 mg/g，提取率为8.45%。

关键词：野生桑黄；总黄酮；正交试验；抗氧化作用

桑黄为多孔菌科植物针层孔的子实体，生于桦、杨等树干上，是一种珍贵的药用真菌，在食品、药品等领域具有很高的利用价值，广泛分布于我国东北、华北、西北等地区[1]。桑黄主要成分为黄酮类和多糖类[2]，其生理活性的研究都集中在抗肿瘤，增强免疫力和肝保护作用[3-5]。桑黄黄酮的提取工艺多采用碱液提取法、热水提取法、乙醇回流提取法，提取时间长，效率低[6-8]，而超声波法是近年来兴起的一项新技术，广泛用于中药成分的提取，具有提取率高，提取时间短等优点，并且不会破坏其中的活性成分[9]。本试验采用超声波辅助提取法提取野生桑黄中的总黄酮，单因素试验的基础上，采用正交试验获得桑黄总黄酮的最佳提取工艺条件，并以VC为对照，通过测定桑黄总黄酮对羟自由基（OH·）及二苯代苦味酰基苯肼自由基（DPPH·）的清除能力来判定其抗氧化活性，为更好地开发和利用该资源提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

长白山杨树野生桑黄：购自延吉长白山特产经营部；无水乙醇、95%乙醇、蒸馏水、乙醚、氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝，石油醚均为国产分析纯；芦丁对照品：中国药品生物制品鉴定所鉴定，批号为100080—200707。

1.2仪器设备

FA1104N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：日本岛津；数显式电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；SHB-111A型循环式多用真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；ZN-500A型高速中药粉碎机：长沙市岳麓区中南制药机械厂；超声波清洗器：上海超声仪器有限公司；202-1A型电热恒温干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品20 mg在60%乙醇中溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到浓度为0.20 mg/mL的标准溶液备用。采用文献[11]的方法绘制标准曲线，用紫外分光光度计于510 nm处测定吸光度，以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得出回归方程。

1.3.2总黄酮含量测定

精确称取1 g桑黄干燥粉末于100 mL三角瓶中，按正交试验设计表，用超声波进行充分提取，得滤液，趁热抽滤，将所得的溶液转入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，放置常温。准确吸取2 mL溶液于25 mL容量瓶中，加入30%的乙醇溶液3 mL，精确加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加入4%NaOH溶液10.0 mL，用蒸馏水定容，摇匀，放置15 min，备用。以试剂空白为参比，用紫外分光光度计于510 nm处测定吸光度[10]。再将所得吸光度值代入标准曲线方程中求出浓度（mg/mL），然后用公式（1）和（2）分别计算总黄酮含量和总黄酮提取率。

总黄酮的含量/（mg/g）=（C×稀释倍数×V）/m（1）

总黄酮的提取率/%=[（C×稀释倍数×V）/（m×1 000）]× 100（2）

式中：C为样品中总黄酮的浓度，（mg/mL）；稀释倍数为25；V为原液体积100 mL；m为样品质量，g。

1.3.3总黄酮单因试验与正交试验

以总黄酮提取效率为评价指标，在维持另外提取条件不变的情况下，分别考察不同乙醇浓度，料液比、超声时间、超声提取功率对桑黄总黄酮提取率的影响。初始料液比为1∶30（g/mL），提取时间为40 min，提取功率为60 W。单因素的范围分别设定为：乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%；料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；超声提取时间 20、30、40、50、60 min；提取功率50、60、70、80、90 W。根据前期单因素试验的结果，每个因素取3个水平进行优化。以总黄酮提取率为指标，采用L9（34）正交表试验确定最佳提取条件正交试验因素水平表如表1。

表1　正交试验因素水平表Table 1　The Orthogonal test factor and levels

1.4桑黄总黄酮抗氧化活性的测定

野生桑黄中总黄酮对OH·的清除能力采用水杨酸捕获法进行测定[11]。

桑黄中总黄酮对有机自由基（DPPH）的清除作用按照文献[12]所述方法进行测定。

2　结果与讨论

2.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对桑黄中总黄酮提取率的影响如图1所示。

图1　乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.1　The effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

从图1可知，总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加出现先上升后下降的趋势。当乙醇浓度小于70%时，总黄酮的提取率随着乙醇浓度的增加而缓慢增加，乙醇浓度为70%时，总黄酮的提取率达到最大值，即5.9%，当乙醇浓度大于70%时，总黄酮提取率逐渐下降，因此超声波提取桑黄总黄酮的最适乙醇浓度为70%。

2.2料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对桑黄中总黄酮提取率的影响如图2所示。

图2　料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2　The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of total flavonoids

从图2可知，总黄酮提取率随着料液比的增加而出现先增加后下降的趋势，当料液比为1∶40（g/mL）时总黄酮提取率为7.05%，达到最大值，此时提取效果最好，因此超声波提取的最适料液比为1∶40（g/mL）。

2.3超声提取时间对桑黄总黄酮提取率的影响

超声提取时间对桑黄总黄酮提取率的影响如图3所示。

图3　超声提取时间对桑黄总黄酮提取率的影响Fig.3　The extracting time on the extraction rate of total flavonoids

由图3可知，桑黄总黄酮提取率随着超声提取时间的增加而出现先增加后下降的趋势，当提取40 min时提取率为7.18%，达到最大，提取效果最好，因此超声波提取的最适提取时间为40 min。

2.4超声提取功率对桑黄总黄酮提取率的影响

超声提取功率对桑黄总黄酮提取率的影响如图4所示。

图4　超声功率对桑黄总黄酮提取率的影响Fig.4　The extracting power on the extraction rate of total flavonoids

从图4可知，桑黄总黄酮提取率随着超声提取功率的增加而出现先上升后下降的趋势，在超声功率为70 W时达到最大值即6.2%，效果最好，因此超声波提取的最适功率为70 W。

2.5正交试验结果

正交试验结果如表2。

表2　桑黄总黄酮超声提取正交试验结果Table 2　Results of ultrasonic extraction of total flavonoids oforthogonal experiment

续表2　桑黄总黄酮超声提取正交试验结果Continue table 2　Results of ultrasonic extraction of total flavonoids of orthogonal experiment

通过对正交试验极差R的分析结果表明，各因素对桑黄总黄酮提取率影响的大小为A>C>B>D，即乙醇浓度为最主要的影响因素，超声提取时间次之，料液比和超声提取功率对结果的影响较小。正交设计试验结果显示，桑黄总黄酮提取最佳工艺组合为A1B3C2D3，即乙醇浓度为60%，料液比为1∶50（g/mL），在超声功率为80W条件下提取40 min。

2.6最佳条件验证

因为最佳试验组合不在正交表内，需要进行最佳组合的验证性试验。按最佳组合A1B3C2D3的条件，即乙醇浓度为60%，料液比为1∶50（g/mL），在超声功率为80 W的条件下对桑黄总黄酮进行提取，提取时间为40 min。测得桑黄总黄酮含量为84.51mg/g，其提取率为8.45%，与正交试验中提取率为7.925%的最高工艺A1B3C3D3相比，提取率较为接近。表明该提取工艺合理，方案可行。

2.7桑黄总黄酮抗氧化活性的研究

2.7.1桑黄总黄酮对DPPH自由基的清除作用

不同浓度的桑黄总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用如图5所示。

图5　野生桑黄黄酮对DPPH·的清除作用Fig.5　The DPPH·scavenging effects of Wild Phellinus Vanini flavonoids

由图5可知，在不同浓度下，桑黄总黄酮和VC对DPPH·均有清除作用，且清除率都随着浓度的增大而增大，桑黄总黄酮清除DPPH·的能力较VC强。

2.7.2水杨酸法测定抗氧化活性

不同浓度的桑黄总黄酮和VC对OH·的清除作用如图6所示。

图6　野生桑黄清除羟自由基的作用Fig.6　The scavenging effects of the Wild Phellinus Vanini flavonoids on OH·

由图6可知，在不同浓度下，桑黄总黄酮和VC对OH·均有清除作用，桑黄总黄酮对OH·清除率随着浓度的增大而增大，总体上桑黄总黄酮清除OH·的能力较VC强。

3　结论

通过单因素试验确定各个单因素的最佳水平，在此基础上进行正交试验确定了实验室超声提取桑黄总黄酮的条件，结果表明，各因素对桑黄总黄酮提取率影响的大小为乙醇浓度为最主要的影响因素，超声提取时间次之，料液比和超声提取功率对结果的影响较小。最佳提取条件是乙醇浓度60%，料液比1∶50（g/mL），超声功率80 W，提取时间40 min，桑黄总黄酮含量为84.51 mg/g，桑黄总黄酮提取率为8.45%。

体外抗氧化实验结果表明，桑黄中黄酮类化合物对DPPH·和OH·均具有较强的清除能力，即桑黄黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化活性，且抗氧化活性较VC强，为日后天然抗氧化剂和功能性食品的开发提供了技术参考。

参考文献：

[1]陈晓平,于翠翠.响应面法优化微波辅助乙醇提取桑黄黄酮工艺的研究[J].食品与发酵科技,2013,49(4):31-36

[2]齐欣,张俊,陈颖,等.6种不同种桑黄有效成分的比较[J].食品科学,2010,31(6):199-201

[3]张万国,胡晋红,蔡溱,等.桑黄抗大鼠肝纤维化作用实验研究[J].中医药学刊,2001,19(5):518-519

[4]Saeed N,Khan MR,Shabbir.Antioxidant activity,total phenolic and total flavonoid contents of whole plant extracts Torilis leptophylla L [J].BMC Complement&Alternative Medicine,2012,16(12):221-232

[5]刘艳芳,杨焱,贾薇,等.药用真菌桑黄总黄酮测定方法研究[J].食用菌学报,2006,13(2):45-48

[6]夏国华,戈延茹,傅海珍,等.超声法提取桑黄总黄酮的工艺研究[J].江苏大学学报(医学版),2010,20(1):40-41,55

[7]回晶,李其久,边媛媛,等.桑黄总黄酮超声提取工艺及其生物活性研究[J].食品科学,2010,31(24):195-198

[8]包海鹰,孙德立.桑黄黄酮提取工艺的研究[J].时珍国医国药,2012, 23(3):516-518

[9]佟永薇.黄酮类化合物提取方法的研究及展望[J].食品研究与开发,2008,29(7):188-190

[10]王卫东,陈复生.陈皮中黄酮类化合物抗氧化活性的研究[J].中国食品添加剂,2007,59(2):59-62

[11]海平,苏雅乐其其格.蒙药小白蒿中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(3):59-63

[12]Su M S,Shyu Y T,Chen P J.Antioxidant activities of citrus herbal product extracts[J].Food Chemistry,2008,111(4):892-896

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.010

收稿日期：2014-05-24

基金项目：国家自然科学基金（31160314）

作者简介：李善姬（1969—），女（朝鲜），副教授，博士，主要从事食品营养与生理活性研究。

*通信作者：梁承武（1968—），男（朝鲜），教授，博士。

Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of Total Flavonoid from Wild Phellinus Vanini

LI Shan-ji1，LIANG Cheng-wu1，*，CUI Cheng-bi2，JIN Yu-ji1，BAI Xue-song1，DUAN Qi1
（1.Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.Food Research Centre，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：The objects of this study were to optimize extraction technology and to research in vitro antioxidant activity of total flavonoids from wild phellinus vanini.The extraction process was optimized by single factor experiment and orthogonal design L9（34）and the antioxidant effect was determined with VCas positive control. The results had indicated that the extraction optimum technological conditions were the solid-liquid ratio 1∶50（g/mL），the concentration of ethanol 60%，the extracting time 40 minutes and the extracting power 80 W，and the total flavonoids content was 84.51 mg/g，the extraction rate was 8.45%.

Key words：wild phellinus vaninin；total flavonoids；orthogonal design；antioxidant activity