前蛋白转化酶枯草溶菌素9抑制剂的研究进展

曾雨薇 综述 罗素新 刘洪沛 审校

(重庆医科大学附属第一医院心血管内科，重庆 400016)

近年来，冠心病成为导致中国乃至全球患者死亡的首要原因。胆固醇升高是冠心病的独立危险因素，亦称直接病因，其中最为重要的是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。新近的荟萃分析［1］发现，LDL-C每降低1 mmol/L，冠心病风险可减少21%。因此，降低胆固醇被视为防治缺血性心脑血管疾病的核心策略。他汀类药物是目前降胆固醇治疗领域的一线药物，其不仅有效降低血浆LDL-C水平，还能减少心脑血管疾病的发病率和病死率。尽管他汀类药物临床应用广泛，优势突出，但存在一定的局限性:(1)一些家族性高胆固醇血症患者，LDL-C基线水平较高，在接受强化他汀类药物治疗后胆固醇水平仍不能达标;(2)他汀类药物虽然一般耐受性良好，但仍有少部分患者由于各种不良反应，不能耐受大剂量或根本不能耐受他汀类药物治疗;(3)尽管他汀类药物能有效预防心血管疾病，但PROVE-IT研究显示，部分心血管疾病高危患者在接受强化他汀类药物(阿托伐他汀80 mg)治疗后仍有较大的心血管事件残余风险，在为期2年的研究中，风险发生率达22.4%［2］，该类患者仍有额外的降脂治疗需求。目前临床实际应用中，可联用胆固醇吸收抑制剂依折麦布和烟酸类药物进一步降低LDL-C，但此类药物降脂效果有限，且现有临床研究尚未发现其可显著减少患者主要心血管终点事件发生率，也只能作为降低LDL-C的二线药物。因此，进一步研发针对脂代谢的不同作用靶点，更为安全、有效的新型降脂药物成为目前血脂领域的研究热点。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)的发现为这些患者提供了新的治疗前景。现对PCSK9抑制剂的研究现状做一综述。

1 PCSK9与高胆固醇血症的关系

PCSK9是一种主要由肝脏合成的分泌型丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族，其基因位于常染色体1p34-32，编码神经凋亡调节转化酶1，参与神经细胞凋亡的调节过程，更重要的是，其与胆固醇代谢直接相关。PCSK9基因功能缺失型突变可致LDL-C明显减少，冠心病的发病率显著降低，而PCSK9基因功能获得型突变则致LDL-C水平大幅度升高，并与一种严重的纯合子家族性高胆固醇血症有关。PCSK9基因突变也是除低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDL-R)和载脂蛋白B基因突变之外，第三个与常染色体显性家族性高胆固醇血症有关的基因突变［3］。

LDL-C主要通过肝细胞表面的LDL-R清除。PCSK9则通过细胞内和细胞外途径调控肝脏的LDL-R水平，进而影响LDL-C的代谢。PCSK9释放入血后与肝细胞表面的LDL-R特异性结合，引导后者进入肝细胞，到达溶酶体，在溶酶体中LDL-R发生降解，肝细胞表面LDL-R减少，肝细胞对LDL-C的清除能力下降，导致LDL-C水平升高，这是细胞外途径。PCSK9在分泌入血前也能调节局部肝脏组织中LDL-R的表达，然而细胞内途径具体机制尚不明确。抑制PCSK9能阻断PCSK9介导的LDL-R降解，上调肝细胞表面的LDL-R水平，从而达到降低LDL-C的目的，是治疗高胆固醇血症的合理靶点。有趣的是，他汀类药物的研究［4］发现他汀类药物在抑制胆固醇合成的同时，可升高血浆PCSK9水平，且存在剂量依赖关系，并与他汀类药物治疗时间成正比，提示PCSK9抑制剂与他汀类药物联用或许能明显提高其降脂效果。

2 PCSK9抑制途径及相关药物

2007年，第一个PCSK9抑制剂诞生，继后，多种不同途径的PCSK9抑制剂应运而生，主要包括:(1)抑制PCSK9的合成:反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)、小分子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA);(2)抑制PCSK9与LDL-R结合:单克隆抗体、小分子多肽。目前已进入临床研究阶段的PCSK9抑制剂见表1。

表1 临床研究阶段的PCSK9抑制剂一览

2.1 抑制PCSK9的合成

2.1.1 ASOs类抑制剂

ASOs通常由8～50个核苷酸组成，其短小序列核苷酸与mRNA结合，抑制蛋白质的转录［5］，达到沉默靶基因的目的。ASOs通过与PCSK9 mRNA结合抑制PCSK9的转录，从而抑制PCSK9的合成。肝脏是易于摄取外源性ASOs类药物的器官，也是PCSK9的主要合成场所，这为ASOs类PCSK9抑制剂聚集于此并充分发挥作用提供了有利的条件，使肝细胞中PCSK9 mRNA水平明显降低，肝细胞表面的LDL-R表达显著增加，LDL-C减少。2007年，Graham等报道了第二代ASOs类PCSK9抑制剂靶向作用于小鼠PCSK9有良好的降脂效果，高脂喂养的小鼠通过皮下注射PCSK9 ASOs治疗6周后，PCSK9 mRNA减少了92%，肝细胞表面LDL-R水平升高了2倍，总胆固醇和LDL-C分别减少了53%和38%，但HDL-C也减少了54%。动物研究证实运用ASOs抑制PCSK9 mRNA可明显降低LDL-C水平，然而随后两项关于 ASOs类药物 SPC-5001和BMS-844421的Ⅰ期研究［6-7］并未得出阳性结果，已在2011年提前终止，原因尚不明确。

锁核酸(locked nucleic acid，LNA)技术也被运用到了PCSK9 ASOs中。LNA作为一种寡核苷酸衍生物，有稳定的空间构象，对RNA有良好的识别能力和亲和力，与天然核酸构成的ASOs相比，LNA构成的新型ASOs结构更加稳定，识别能力和亲和力更强。研究证实了以人和动物PCSK9为靶标的LNA的有效性，人肝细胞转染LNA ASOs后，PCSK9水平明显减少，肝细胞表面LDL-R增多。小鼠尾单次静脉注射LNA ASOs后，肝细胞中PCSK9 mRNA减少了60%，药效持续16 d，肝脏表面LDL-R水平上调2.5～3倍持续8 d以上［5］。在非人灵长类动物试验中，使用PCSK9特异性的LNA ASOs药物SPC-5001后，PCSK9水平减少了85%，LDL-C减少了50%，总胆固醇减少水平与 LDL-C相一致［8］。以 PCSK9为靶标的 LNA ASOs为高胆固醇患者提供了一种有效的治疗策略，未来可能成为他汀类药物治疗的补充，其药物SPC-5001的Ⅰ期临床研究正在进行中。

2.1.2 siRNA类抑制剂

抑制PCSK9合成的另一种方法是siRNA，它从机制上有别于ASOs。PCSK9 siRNA与PCSK9 mRNA靶向的RNA干扰沉默复合体结合，抑制PCSK9 mRNA的转录，同时启动了靶mRNA序列特异性的降解机制，有序、高效、特异地降解PCSK9 mRNA，导致基因表达沉默［9］。PCSK9 siRNA被研制成可静脉注射的脂质化微颗粒，以减少毒副作用及对其他siRNA的干扰。在小鼠和大鼠试验中，单次静脉注射脂质体siRNA，可使其PCSK9 mRNA最大沉默50%～60%，减少PCSK9水平，降低LDL-C达30%。在非人灵长动物中单剂量给药可快速起效，48 h后LDL-C降低了50% ～60%，药效持续3周，对HDL-C、三酰甘油无影响。ALN-PCS是Alnylam公司研发的脂质体siRNA类PCSK9抑制剂，其Ⅰ期研究［10］纳入了32例 LDL-C＞3.0 mmol/L的健康志愿者，接受不同单剂量静脉给药，研究结果显示，该药起效快、作用持久，不同剂量组间存在明显的量效关系，观察到最大剂量效应最强，PCSK9减少达70%，LDL-C降低达40%，HDL-C、脂蛋白a无明显改变。ALN-PCS安全性、耐受性好，无药物相关的严重不良反应报道。该药的Ⅰ期研究临床有效终点取得了阳性结果。由于Ⅰ期研究样本量小，未来还需大型研究来进一步验证其治疗高胆固醇血症的有效性和安全性。

2.2 抑制PCSK9与LDL-R结合

2.2.1 小分子多肽类抑制剂

PCSK9作用于细胞表面的LDL-R，是基于它们之间直接的蛋白质-蛋白质相互作用，运用抗体对抗PCSK9可破坏其相互作用，从而抑制PCSK9介导的肝细胞表面的LDL-R降解。2008年，Mayer等研究发现，膜联蛋白AnxA2与PCSK9的CHRD片段特异性结合，抑制该区域与LDL-R的相互作用，其小分子模拟肽为抑制PCSK9提供了新的思路。LDL-R的EGFA段模拟多肽类药物1D05-IgG2为单克隆抗体类模拟肽，对PCSK9的催化区具有高度亲和力，与LDL-R竞争性结合PCSK9，抑制PCSK9对LDL-R的降解能力，增加肝细胞表面LDL-R的水平。动物试验［11］中，猕猴单剂量注射1D05-IgG2后，LDL-C减少达50%。然而PCSK9与小分子接触面积有限，产生的疏水作用不强，结合后容易脱落，且小分子模拟肽设计难度较大，这都为该类药物的开发设置了难度。2014上半年，CVI公司研发的小分子PCSK9抑制剂CVI-LM001已申报临床。

2.2.2 单克隆抗体类抑制剂

在目前众多的PCSK9抑制剂中，单克隆抗体类药物发展最为迅速。2009年，Duff等研究发现PCSK9特异性抗体通过识别PCSK9与LDL-R结合的前片段-催化域，阻断PCSK9与LDL-R之间的相互作用，减少PCSK9介导的LDL-R降解，提高LDL-C的清除率。同年，Chan等为非人灵长类动物单次静脉注射人源PCSK9单克隆抗体mAb1，发现其可有效降低 LDL-C水平，证明了单克隆抗体降低 LDL-C的有效性。PCSK9作为一种蛋白质大分子，较易通过杂交瘤技术获得单克隆抗体。随着近几年的快速发展，许多PCSK9单克隆抗体类药物已进入临床试验阶段(见表1)，其中热门研究药物为Amgen公司的evolocumab(AMG-145)和 Regeneron/Sanofi公司的 alirocumab(REGN-727/SAR-236553)，已进入Ⅲ期临床试验。

Evolocumab和alirocumab先后进入临床试验，Ⅰ期研究［12-13］中两种药物均能迅速、有效地降低LDL-C水平，且耐受性良好，无严重的药物不良反应，治疗相关不良反应发生率与安慰剂组相似。

Evolocumab和 alirocumab的Ⅱ期研究［14-20］显示，两种药物单独或联合他汀类药物治疗除了有效降低LDL-C水平外，还影响了其他致动脉粥样硬化脂蛋白水平:明显降低总胆固醇、非HDL-C、载脂蛋白B水平，且下降幅度与LDL-C相似;有效降低脂蛋白a水平，在 GAUSS研究［21］中单用evolocumab使脂蛋白 a水平降低了20%～26%，而在alirocumab的一项研究中，联合阿托伐他汀80 mg治疗可使脂蛋白a明显下降达34.7%［18］;轻微升高HDL-C水平，三酰甘油轻微下降或无明显变化。Ⅱ期试验的安全性数据十分鼓舞人心，两种药物的一般耐受性良好、不良反应少。

Evolocumab和alirocumab的Ⅲ期研究正在进行中，纳入人数较Ⅱ期研究明显增多，同时随访时间延长，其中10项试验结果于2014年先后公布，包括evolocumab 的 MENDEL-2、GAUSS-2、DESCARTES-2、LAPLACE-2、RUTHERFORD-2、TESLA 研究，以及 alirocumab的 ODYSSEY MONO、ODYSSEY COMBOⅡ、ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ、ODYSSEY Long-Term研究。MENDEL-2［22］、LAPLACE-2［23］、DESCARTES-2 研 究［24］和RUTHERFORD-2研究［25］验证了evolocuma单独或联合他汀类药物(伴或不伴依折麦布)治疗对于非家族性或家族性高胆固醇血症患者安全有效。对于罕见的纯合子家族性高胆固醇血症患者，evolocumab也同样安全有效，TESLA研究［26］发现 evolocumab可使该类患者LDL-C水平从基线显著降低31%。GAUSS-2研究［27］在evolocumab耐受性方面作了相关报道，他汀类药物不耐受患者使用evolocumab后仅有23%出现肌肉相关不良反应，且发生率与使用依折麦布组无明显差异。Alirocumab的ODYSSEY系列研究结果涉及多个治疗领域。首先公布的ODYSSEY MONO研究［21］通过比较证明了alirocumab降脂效果明显优于依折麦布。ODYSSEY COMBOⅡ研究［28］针对使用最大耐受剂量他汀类药物治疗血脂仍未达标的心血管疾病高危患者，研究发现alirocumab对于这类患者降LDL-C效果明显、药效持久，52周时 alirocumab组LDL-C仍保持在较基线水平降低49.5%。ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ研究［29］进一步发现即使对于杂合子家族性高胆固醇血症患者，alirocumab仍能明显降低LDL-C达49%，且52周时LDL-C降低程度依旧保持在与24周时接近的水平。ODYSSEY Long-Term研究［29］通过事后分析探讨了alirocumab对于心血管事件高危患者主要心血管事件的影响，结果发现，治疗65周后，alirocumab组患者主要心血管事件绝对发生率为1.4%，安慰剂组为3.0%，相对风险下降了54%。虽然为事后分析结果，但也为alirocumab在降低心血管事件风险方面增添了新的证据。

现有的短期研究显示单克隆抗体类药物降低LDL-C的幅度超过50%，这一降幅相当于大剂量的强效他汀类药物治疗，且安全性与耐受性良好，无严重不良反应。至此，单克隆抗体已具备了作为优秀降胆固醇药物的基本条件。然而，在血脂异常干预以及心血管疾病的防治中，LDL-C的降低只能作为一个替代终点，不能单凭替代性终点评价药物疗效。已公布的研究周期较短、样本量小，缺乏长期有效性和安全性的证据。为了进一步评估PCSK9单克隆抗体对心血管事件的影响，evolocumab和alirocumab均开展了以心血管事件的发生率为主要终点的Ⅲ期随机双盲平行对照研究——FOURIER研究和ODYSSEY OUTCOMES研究。两个研究分别纳入了22500例和18000例心血管疾病患者，随访时间5～6年，主要终点包括冠心病死亡、非致死性心肌梗死、非致死性缺血性卒中、需住院的不稳定型心绞痛、冠状动脉血运重建等［30］，研究预计2018年结束，届时才能比较可靠地判定这类药物对临床主要心血管终点事件的影响。

3 展望

从发现PCSK9基因突变到研发PCSK9抑制剂类药物进入临床试验不到10年的时间里，PCSK9抑制剂成绩斐然，有望发展成为一种前景广阔的药物。目前正在研究的PCSK9抑制剂中，小分子类药物CVILM001正在申报临床，LNA类药物SPC-5001和siRNA类药物ALN-PCS处于Ⅰ期研究阶段，单克隆抗体类PCSK9抑制剂发展最为迅速，已进入Ⅲ期临床试验。2014年8月，安进公司率先向美国食品药品监督管理局提交了首个PCSK9抑制剂evolocumab的上市申请。虽然现有临床研究已证实PCSK9抑制剂能显著降低LDL-C水平，且安全性良好，但强效降低LDL-C水平是否能转化为降低心血管事件风险?持续极低水平的LDL-C是否会有其他不良反应?长期使用PCSK9抑制剂是否安全?PCSK9抑制剂是否能和他汀类药物一样，成为降脂治疗的一线药物甚至超越他汀类药物?这些问题亟待目前的研究结果以及今后进一步大量的临床研究验证。

［1］Baigent C，Blackwell L，Emberson J，et al.Efficacy and safety of more inten-sive lowering of LDL cholesterol:a meta-analysis of data from 170000 participants in 26 randomised trials［J］.Lancet，2010，376(9753):1670-1681.

［2］Murphy SA，Cannon CP，Wiviott SD，et al.Reduction in recurrent cardiovascular events with intensive lipid-lowering statin therapy compared with moderate lipid-lowering statin therapy after acute coronary syndromes from the PROVE ITTIMI 22(Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy-Thrombolysis In Myocardial Infarction 22)trial［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(25):2358-2362.

［3］Dadu RT，Ballantyne CM.Lipid lowering with PCSK9 inhibitors［J］.Nat Rev Cardiol，2014，11(10):563-575.

［4］Guo YL，Liu J，Xu RX，et al.Short-term impact of low-dose atorvastatin on serum proprotein convertase subtilisin/kexin type 9［J］.Clin Drug Investig，2013，33(12):877-883.

［5］Gupta N，Fisker N，Asselin MC，et al.A locked nucleic acid antisense oligonucleotide(LNA)silences PCSK9 and enhances LDLR expression in vitro and in vivo［J］.PLoS One，2010，5(5):e10682.

［6］Anon.Mutiple ascending does study of SPC5001 in treatment of healthy subjects and subjects with FH ［EB/OL］.2011-11-21［2013-02-25］.http://www.clinicaltrials.gov/cts/show/NCT01350960?term=SPC5001＆rank=1.

［7］Anon.Safety study of BMS-844421 for treatment of hypercholesterolemia［EB/OL］.2011-01-25［2013-02-25］.http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01082562?term=BMS-844421＆rank=1.

［8］Lindholm MW，Elmén J，Fisker N，et al.PCSK9 LNA antisense oligonucleotides induce sustained reduction of LDL cholesterol in nonhuman primates［J］.Mol Ther，2012，20(2):376-381.

［9］Vaishnaw AK，Gollob J，Gamba-Vitalo C，et al.A status report on RNAi therapeutics［J］.Silence，2010，1(1):14.

［10］Fitzgerald K，Frank-Kamenetsky M，Shulga-Morskaya S，et al.Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9)and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers:a randomised，single-blind，placebo-controlled，phase 1 trial［J］.Lancet，2014，383(9911):60-68.

［11］Ni YG，Condra JH，Orsatti L，et al.A proprotein convertase subtilisin-like/kexin type 9(PCSK9)C-terminal domain antibody antigen-binding fragment inhibits PCSK9 internalization and restores low density lipoprotein uptake［J］.J Biol Chem，2010，285(17):12882-12891.

［12］Dias CS，Shaywitz AJ，Wasserman SM，et al.Effects of AMG 145 on low-density lipoprotein cholesterol levels:results from 2 randomized，double-blind，placebo-controlled，ascending-dose phase 1 studies in healthy volunteers and hypercholesterolemic subjects on statins［J］.J Am Coll Cardiol，2012，60(19):1888-1898.

［13］Stein EA，Mellis S，Yancopoulos GD，et al.Effect of a monoclonal antibody to PCSK9 on LDL cholesterol［J］.N Engl J Med，2012，366(12):1108-1118.

［14］Giugliano RP，Desai NR，Kohli P，et al.Efficacy，safety，and tolerability of a monoclonal antibody to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 in combination with a statin in patients with hypercholesterolaemia(LAPLACE-TIMI 57):a randomised，placebo-controlled，dose-ranging，phase 2 study［J］.Lancet，2012，380(9858):2007-2017.

［15］Koren MJ，Scott R，Kim JB，et al.Efficacy，safety，and tolerability of a monoclonal antibody to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 as monotherapy in patients with hypercholesterolaemia(MENDEL):a randomised，doubleblind，placebo-controlled，phase 2 study［J］.Lancet，2012，380(9858):1995-2006.

［16］Raal F，Scott R，Somaratne R，et al.Low-density lipoprotein cholesterol-lowering effects of AMG 145，a monoclonal antibody to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 serine protease in patients with heterozygous familial hypercholesterolemia:the reduction of LDL-C with PCSK9 inhibition in heterozygous familial hypercholesterolemia disorder(RUTHERFORD)randomized trial［J］.Circulation，2012，126:2408-2417.

［17］Sullivan D，Olsson AG，Scott R，et al.Effect of a monoclonal antibody to PCSK9 on low-density lipoprotein cholesterol levels in statin-intolerant patients:the GAUSS randomized trial［J］.JAMA，2012，308(23):2497-2506.

［18］Roth EM，McKenney JM，Hanotin C，et al.Atorvastatin with or without an antibody to PCSK9 in primary hypercholesterolemia［J］.N Engl J Med，2012，367:1891-1900.

［19］McKenney JM，Koren MJ，Kereiakes DJ，et al.Safety and efficacy of a monoclonal antibody to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 serine protease，SAR236553/REGN727，in patients with primary hypercholesterolemia receiving ongoing stable atorvastatin therapy［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59(25):2344-2353.

［20］Stein EA，Gipe D，Bergeron J，et al.Effect of a monoclonal antibody to PCSK9，REGN727/SAR236553，to reduce low density lipoprotein cholesterol in patients with heterozygous familial hypercholesterolaemia on stable statin dose with or without ezetimibe therapy:a phase 2 randomised controlled trial［J］.Lancet，2012，380(9836):29-36.

［21］Roth EM，Taskinen MR，Ginsberg HN，et al.Monotherapy with the PCSK9 inhibitor alirocumab versus ezetimibe in patients with hypercholesterolemia:results of a 24 week，double-blind，randomized phase 3 trial［J］.Int J Cardiol，2014，176(1):55-61.

［22］Koren MJ，Lundqvist P，Bolognese M，et al.Anti-PCSK9 monotherapy for hypercholesterolemia—the MENDEL-2 randomized，controlled phase 3 clinical trial of evolocumab［J］.J Am Coll Cardiol，2014，63(23):2531-2540.

［23］Robinson JG，Rogers WJ，Nedergaard BS，et al.The LAPLACE-2 trial:a phase 3，double-blind，randomized，placebo and ezetimibe controlled，multicenter study to evaluate safety，tolerability and efficacy of evolocumab(AMG 145)in combination with statin therapy in subjects with primary hypercholesterolemia and mixed dyslipidemia［J］.Clin Cardiol，2014，37(4):195-203.

［24］Blom DJ，Hala T，Bolognese M，et al.A 52-week placebo-controlled trial of evolocumab in hyperlipidemia［J］.N Engl J Med，2014，370(19):1809-1819.

［25］Raal F，Scott R，Somaratne R，et al.The addition of evolocumab(AMG 145)allows the majority of heterozygous familial hypercholesterolemic patients to achieve low-density lipoprotein cholesterol goals—results from the phase 3 randomized，double-blind，placebo-controlled study［abstract 400-005］［R］.Presented at ACC Scientific Sessions，2014.

［26］Raal FJ，Honarpour N，Blom DJ，et al.Inhibition of PCSK9 with evolocumab in homozygous familial hypercholesterolaemia(TESLA Part B):a randomised，double-blind，placebo-controlled trial［J］.Lancet，2015，385(9965):341-350.

［27］Stroes E，Colquhoun D，Sullivan D，et al.Anti-PCSK9 antibody effectively lowers cholesterol in patients with statin intolerance:the GAUSS-2 randomized，placebo-controlled phase 3 clinical trial of evolocumab［J］.J Am Coll Cardiol，2014，63(23):2541-2548.

［28］Cannon CP，Cariou B，Blom D，et al.Efficacy and safety of alirocumab in high cardiovascular risk patients with inadequately controlled hypercholesterolaemia on maximally tolerated doses of statin:the ODYSSEY COMBOⅡrandomized controlled trial［J/OL］. Eur Heart J，2015，9［2015-02-16］.http://dx.doi.org/10.1093/eurheartj/ehv028.

［29］Michael O.Huge decreases in LDL cholesterol with alirocumab:ODYSSEY［EB/OL］.2014-08-31.http://www.medscape.com/viewarticle/830729#vp_3.

［30］Dadu RT，Ballantyne CM.Lipid lowering with PCSK9 inhibitors［J］.Nat Rev Cardiol，2014，11(10):563-575.