萃取-水相乙基化衍生结合GC-CVAFS法测定大米和鱼样品中的甲基汞

刘沛明

（广西壮族自治区合浦县疾病预防控制中心，广西合浦536100）

萃取-水相乙基化衍生结合GC-CVAFS法测定大米和鱼样品中的甲基汞

刘沛明

（广西壮族自治区合浦县疾病预防控制中心，广西合浦536100）

建立萃取-水相乙基化衍生结合GC-CVAFS测定大米和鱼样品中甲基汞的方法。应用碱消解和有机溶剂CH2Cl2萃取技术，将样品中的甲基汞萃取出来并预富集至水相，而后进行乙基化反应，最后用GC-CVAFS联用系统分离测定。实验结果显示：方法检出限0.001 2ng/g，萃取前后标准样品回收率分别为97%和95%，精密度RSD均小于5.8%。该方法快速、精密度高、检测限低，能用于环境中痕量甲基汞的检测与分析。

大米；鱼；甲基汞；气相色谱-冷原子荧光法

研究认为，国外和我国沿海地区，甲基汞主要通过食用海产品和鱼类摄入，而在中国内地，食用大米是甲基汞暴露的主要途径[9]。因此，本文以大米作为植物样品，鱼作为动物样品，经过碱消解后，大米样品用CH2Cl2萃取分离，鱼样经过水相乙基化-Tenax管富集，最后经气相色谱和冷原子荧光法（GC-CVAFS）进行测定，此实验前处理方便，样品的测定精密度高。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：冷原子荧光仪（CVAFS）（Brooks Rand III，美国）；石英玻璃管（填充石英棉）、镍铬丝电热线圈；150mL高硼硅酸玻璃气泡瓶；高速离心机（3 500 r/min）；样品振荡机；Tenax-TA（Alltech，20/35目）富集管（Tenax，100mg）；数据处理软件（Mercury Guru 4）；配有超级恒温仪的气相色谱柱（15%OV-3，Chromosorb W-AW80/100，内径0.5 cm，长75 cm，美国Brooks Rand）；变压器（0～220V）。

主要试剂：250 g/L KOH甲醇溶液；二氯甲烷（CH2Cl2，分析纯）；去离子水；2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（136g乙酸钠和59mL冰乙酸溶于去离子水中，定容至0.5L）；10g/L乙基化试剂（NaBEt4）（1.0g NaBEt4溶于100mL 20g/L KOH溶液，摇匀，冷冻避光保存）；干燥管（用颗粒状的苏打填充）；氯化甲基汞标准溶液（1μg/mL，Brooks Rand Ltd，美国）；标准样品（Tort-2）。

1.2 样品处理

1.2.1 碱消解

准确称取0.1～0.2g干生物样品（湿重：0.5～0.8g，m0），置于50mL特氟龙消解罐中。加入5mL预先配置的KOH甲醇溶液，用水浴消解或烘箱消解3h，消解温度约75～80℃（用水浴锅更安全，烘箱不稳定易使消解罐变形）。消解过程中，每隔30min摇晃一次，使消解液与样品充分接触。消解完成后在常温下冷却至室温，再加入浓HCl约3mL，同时作试剂空白试验。

1.2.2 萃取和反萃取

将10mL CH2Cl2加入到消解液中并称其质量（m1），加入到消解的大米和标准物质样品Tort-2的离心管中，密封振荡30min，再放入离心机中以3500 r/min离心25min，分层后抽掉上层消解液，转移底部CH2Cl2至50mL的特氟龙瓶中，并称其质量（m2），超纯水定容至45mL。鱼样品和部分Tort-2不进行有机萃取，直接进行样品测定。

1.2.3 反萃取到水相富集

将特氟龙瓶放在水浴锅中，开始水温控制在45～50℃下气化可见CH2Cl2，然后再将温度升高到80℃，以100～200mL/min的流速用N2吹脱约5min，以赶尽残余的有机相，最后用去离子水定容待测。有机相中的甲基汞经过反萃取试验后又被富集到水相中。

1.3 样品测定

1.3.1 实验操作流程

实验操作流程如图1、图2所示。具体实验操作步骤如下：

1）乙基化反应

在气泡瓶中准确加入定量样品，并添加超纯水稀释到50mL左右，加入200μL缓冲溶液（HAc-NaAc），随后迅速加入100μL乙基化反应试剂（NaBEt4），迅速盖上气泡瓶瓶盖，摇匀后放置15min让其充分反应。经乙基化后反应产物为易挥发的甲基乙基汞（甲基汞和NaBEt4反应生成）和二乙基汞（Hg2+和NaBEt4反应生成）。

2）Tenax管富集有机汞

水相乙基反应完成后，通高纯氮气，以200～300mL/min的速度吹脱15min，使气泡瓶中的乙基化产物富集在Tenax上（见图1）。

图1 乙基化反应和Tenax富集装置

3）GC-CVAFS检测

以50mL/min的氩气为载气通过Tenax管并连接到气象色谱仪上，再将Tenax在20s内迅速升温到80～120℃，使各种形态的汞释放后随着载气进入到色谱柱（GC）中，由于分离系数不同的，甲基乙基汞和二乙基汞通过700～900℃的石英沙管，分解成单质汞进入到冷原子荧光检测仪中（见图2）。出峰包含3个峰，依次代表：Hg0、甲基汞和Hg2+。甲基汞标准和大米样品色谱图如图3所示。

图2 GC-CVAFS分离测定流程示意图

图3 甲基汞标准和大米样品色谱图

1.3.2 样品浓度计算

分析样品中的甲基汞含量以峰面积计算，公式如下：

式中：As——分析样品甲基汞峰面积；

Ab——空白甲基汞峰面积；

SF——标准曲线斜率（见图4）；

m0——称取样品的质量，g；

V0——样品定容体积；

图4 甲基汞的标准工作曲线

V1——加入到气泡瓶中样品体积，L；

m1——CH2Cl2初始加入量，g；

m2——萃取后转移出来剩余CH2Cl2量，g。

式（1）用来计算经过萃取和反萃取样品的浓度（大米和Tort-2），式（2）用来计算直接测定样品的浓度（鱼、头发、血液和Tort-2）。

2 结果与讨论

2.1 实验参数优化

在加入CH2Cl2后振荡时，要使振荡器的振荡方向与离心管长度方向保持一致，且强度要大，保证消解液和CH2Cl2充分混合[10]。定容后加样体积根据生物样品甲基汞含量确定，无污染地区的大米、淡水鱼加20mL足以检测出，如海鱼和一些污染地区的样品，则加样量应相应减少。氮气吹脱时间达到15min，流速达到250mL/min时，水相中甲基汞可以全部被吹脱富集到Tenax管上；若吹脱速度加大，会降低Tenax的捕捉效率，速度降低，则需要加长氮气的吹脱时间，所以流量一般设在250mL/min左右。实验还表明，GC温高，载气速度快，出峰速度就越快，但可能造成峰分离不开；反之，则分离好，但可能造成峰型拖尾，出峰速度慢，所以需根据峰的分离情况调节柱温和气流速度。

研究表明，1mL 250g/L KOH甲醇溶液可以完全释放0.25g干重生物样品中的甲基汞[11]。本实验中鱼样甲基汞含量较高，不需进行有机提取就可直接测定，如果含量较低的生物样品，需萃取后才能测定，避免基质的干扰。研究还表明在乙基化反应过程中，pH在1～2左右，且二氯甲烷和氢氧化钾/甲醇消解液体积比为3∶1时，经萃取和反萃取后的甲基汞回收率接近100%[11]。

2.2 标准曲线及检出限

用1.0μL/mL甲基汞标准溶液配制1 ng/L的实验标准溶液，分别吸取0，50，100，150，200μL于气泡瓶，按照样品测定的实验步骤进行处理。以汞的绝对量（pg）为横坐标，对应的积分面积为纵坐标制作标准曲线，如图4所示。该测定系统的绝对最低检测限为0.60pg，如称0.50g样品，将富集到水相的样品全部加入到反应瓶中按上述步骤测定，则该方法的检出限为0.0012ng/g。

2.3 方法的精密度和准确度

标准物质样品测定值结果见表1，所有平行样品测定5次，空白值均低于检测限。萃取测定的Tort-2样品标准平均回收率为95%，精密度为5.8%。碱消解后直接测定的标准物质样品Tort-2平均回收率为97%，精密度为5.0%。

表1 标准物质样品测定值

同时对已知甲基汞含量的大米和鱼样品加入已知量的甲基汞汞标，按照消解和萃取的实验操作步骤分别对大米样品和鱼样品做加标回收实验，4组实验结果见表2，加标回收率在94%～110%，平均回收率为101%。以上标准物质和加标回收实验测定结果表明，此方法准确可行。

2.4 大米和鱼样品的测定

实验样品中的鱼样和大米样品采自超市（n=6），大米来自6个品牌，鱼的种类包括鲫鱼、草鱼、大黄鱼和沙带鱼。大米中甲基汞含量范围为0.11～2.3ng/g，平均值为2.1ng/g；鱼体中甲基汞的测定显示其含量范围在5.8～70ng/g之间，平均含量为51 ng/g。部分大米和鱼样品平行测定结果见表3。

表2 大米和鱼样品中甲基汞加标回收实验测定结果

表3 大米和鱼样品中甲基汞的含量

3 结束语

随着人们对环境样品中甲基汞含量检测限和准确性要求的提高，高效、准确地测定甲基汞显得尤为重要。本文采用碱消解、二氯甲烷萃取、水相乙基化、最后通过气相色谱-冷原子荧光（GC-CVAFS）法来检测大米和鱼样中的痕量甲基汞。该方法具有对样品的选择性小、步骤简洁、快速和绝对检测限低、精密度高等优点，能满足对环境中甲基汞检测快速、准确的要求。

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Determ ination of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapor atom ic fluorescence spectrometry and solvent extraction-aqueous phase ethylation

LIU Peiming
（The Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and prevention in Hepu County，Hepu 536100，China）

This paper stablished a determination method of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence（GC-CVAFS）with solvent extraction after aqueous phase ethylation.An alkaline digestion and an organic solvent（CH2Cl2）extraction technique were developed to extract the methylmercury in rice and fish.The extracted methylmercury samples were then pre-concentrated for aqueous phase ethylation.The last step was to determine the samples by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence.The experimental results have shows:the absolute detection limit is 0.001 2 ng/g；the average recovery of standard materials of extraction and nonextraction are 95%and 97%，respectively；and the relative standard deviation（RSD）is less than 5.8%.Thismethod can be also used to extract trace amounts ofmethylmercury contents in enviroment.

rice；fish；methylmercury；gas chromatographic-cold vapor atomic fluorescence spectrometric method

A文章编号：1674-5124（2015）06-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.013

0 引言

汞是一种高毒性污染物，能通过大气长距离迁移造成全球性的污染，被我国列为优先污染物。自然界中的汞以有无机态和有机态储存在生物圈的各介质中。目前国内关于测定生物样品中甲基汞的方法较多，有苯萃取-气相色谱电子捕获法[1-2]、液相色谱-原子荧光法（HPLC-AFS）[3]、萃取-液相色谱法[4]、甲苯萃取-原子荧光法（AFS）[5]、气相色谱-原子吸收法（GC-AAS）[6-8]等。这些方法存在灵敏度低、精密度差、取样量大、对样品的要求较高，样品前处理过程较繁琐或所用试剂对人体健康有潜在危害等问题，很难准确快速地测定出环境生物样品中的痕量甲基汞，所以，国外多采用萃取结合乙基化法，此方法精密度高。本文旨在简化和优化国内对植物和生物样品中的甲基汞测定方法。

2014-11-28；

2015-01-09

刘沛明（1974-），男，主管技师，主要从事卫生检验工作。