施氏鲟肿嘴病快速检测方法的研究*

2015-07-18刘双凤邹作宇袁美云董宏伟吕延玲哈尔滨市农业科学院水产分院哈尔滨150028

江西水产科技 2015年1期

刘双凤邹作宇袁美云董宏伟吕延玲(哈尔滨市农业科学院水产分院，哈尔滨150028)

施氏鲟肿嘴病快速检测方法的研究*

刘双凤邹作宇袁美云董宏伟吕延玲
(哈尔滨市农业科学院水产分院，哈尔滨150028)

以施氏鲟(Acipenserschrenckii)肿嘴病病原菌异常嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)为抗原，免疫兔获得高免血清，建立一种快速检测施氏鲟肿嘴病病原菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别是为107CFU和1∶100000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应均呈阴性;阻断试验中的阻断率达67.3%;交叉反应和阻断试验的结果表明该方法具有较高的特异性。将此方法标准化后，对35份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟进行检测，阳性的检出率分别为88.6%和14.3%，表明该技术不但可以检测已经发病的施氏鲟，而且还可以检测带菌的施氏鲟。

施氏鲟;肿嘴病;异常嗜糖气单胞菌;间接ELISA

施氏鲟(Acipenserschrenchii)属于鲟形目，鲟科，鲟属，主要分布在黑龙江省，具有独特的食用价值、经济价值和良好的繁殖性能，是中国鲟鱼的主要养殖品种之一。近年来由于其人工养殖技术迅速的发展，黑龙江、北京、辽宁、湖北、广东、江西、贵州、重庆等许多省市成功地开展了鲟鱼人工养殖［1］。随着鲟鱼养殖规模的扩大，密度增加，施氏鲟鱼频繁暴发大规模的疾病。其中，细菌性败血症、肠炎、肿嘴病最为突出，已严重影响到鲟鱼产业的健康发展［2］。细菌性肿嘴病症状主要表现在在病鱼口部四周充血、肿胀，不能活动，摄食困难，口部和体表伴有水霉着生，肛门红肿，剖检后发现在肠道内少量食物或无食物，肝肿大。该病在20cm以下的幼鲟阶段发生较多，可造成幼鲟死亡。该病传播速度快、流行广、经济损失较重。经实验室分离出该病病原菌并通过人工感染试验证明，即为施氏鲟鱼肿嘴病病原菌。对该病原进行生理生化鉴定和16srRNA基因序列同源性分析，确定为气单胞菌属中的异常嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)。

在鱼类的致病菌中，气单胞菌是主要的致病菌之一。其中，嗜水气单胞菌［3－5］、维氏气单胞菌［6］、豚鼠气单胞菌［7］均可感染鲟鱼引起疾病的发生，给鲟鱼养殖业造成重大的经济损失。本研究以施氏鲟肿嘴病病原菌异常嗜糖气单胞菌为研究对象，建立间接ELISA检测技术，以期为养殖鲟鱼肿嘴病的快速检测提供可以使用的方法，并为开发诊断该病的试剂盒提供理论基础和实验资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用菌株——试验用菌分离于患肿嘴病施氏鲟并鉴定。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、大肠肝菌(Escherichiacoli)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)由大连水产学院微生物实验室惠赠。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)购于广东省微生物研究所菌种保藏中心。

试验动物——纯种新西兰白兔购于哈尔滨罗来生物科技发展有限公司实验动物事业部;回归感染试验用的施氏鲟鱼由哈尔滨市农业科学院水产分院提供。

试验试剂——免疫用弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购于美国Sigma公司;酶标抗体、兔阴性血清购自北京Solarbio科技公司，工作浓度为1∶1000。

1.2 抗原的制备

试验方法参照樊景凤［8］，将异常嗜糖气单胞菌接种于普通营养琼脂平板培养基上，30℃培养24h后，用无菌的生理盐水清洗脱、离心、洗涤后，加入甲醛溶液灭活，(终浓度达0.5%)。24h后，运用菌落计数法检测灭菌效果。离心机4000r/min离心5min后，去掉上清液，用灭菌的生理盐水洗涤3次后，用显微镜血球计数板计菌数，配制出浓度约为1× 108CFU/mL的菌悬液作为免疫家兔的抗原。弗氏佐剂与菌悬液1∶1比例混合，用两只注射器分别吸入相同体积的弗氏佐剂与菌悬液，无菌操作用无菌软件管连接后反复推拉，最后液体变成油包乳状后(滴到水里不散开即可)，抗原制备完成。

1.3 抗血清的制备

选择2只1.5kg左右的健康新西兰未孕雌兔，背部皮下6点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔周期为7d，最后一次免疫7d后，耳静脉采血，析出血清后，用试管凝集法测定抗体的效价及交叉反应的效价，效价达到1∶1280以上即可使用。有交叉反应的菌株，在免疫的血清中加入过量的该菌细胞，混合均匀后，冰箱里4℃过夜，再用离心机离心、过滤除掉该菌。过滤后的血清经过交叉反应测定后如无交叉反应，即可以分装，保存于－20℃冰箱中备用。

1.4 间接ELISA方法的建立

1.4.1 间接ELISA检测程序步骤

用pH9.6的碳酸盐缓冲液(PBS)稀释异常嗜糖气单胞菌抗原，加入96孔聚苯乙烯酶标反应板的孔内，100μL/孔，干燥箱60℃烘干;用PBST缓冲液洗涤3次后;每孔加入5%脱脂乳－PBST封闭液，300μL/孔，37℃培养箱中封闭1h;洗涤3次;加入适当稀释的阳性血清和阴性血清，100μL/孔，37℃培养箱中孵育1h;洗涤3次;加入羊抗兔IgG－HRP酶标抗体，100μL/孔，37℃培养箱中孵育1h;洗涤3次;加新配制的OPD－H2O2底物溶液，100μL/孔，37℃培养箱中避光孵育10min;加入2mol/LH2SO4终止反应，50μL/孔;10min后用酶标仪OD492下读值，进行结果判定。

1.4.2 确定抗原和抗体最适工作浓度

采用棋盘滴定法，具体过程如下:将108CFU/mL的异常嗜糖气单胞菌悬液从1∶10至1∶10000做倍比稀释，每个稀释度包被2孔，100μL/孔;干燥箱60℃烘干;把阳性血清按1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000、1∶30000进行稀释，按与抗原浓度变化垂直的方向加入各个板孔，100μL/孔，培养箱37℃放置1h;酶标抗体作1∶1000稀释，按以上步骤进行间接ELISA测定。酶标仪读值，以能产生OD492值1.0左右，且P/N值最大的抗原抗体稀释度为最佳稀释度;设空白对照，加样顺序为:包被抗原——封闭液——底物。

P/N=(阳性对照OD492值－空白对照OD492值)/(阴性对照OD492值－空白对照OD492值)

1.4.3 免疫血清敏感性试验

将109CFU/mL的异常嗜糖气单胞菌菌悬液从1∶10至1:1000000做系列稀释，每个稀释度包被2孔(100μL/孔)，干燥箱60℃烘干，将血清稀释到最适工作浓度后，以确定最小的抗原检测浓度。酶标仪读值，以产生OD492值接近1.0，且P/N值≥2.1判为阳性。

1.4.4 特异性实验

交叉实验:用浓度均为107CFU/mL的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维氏弧菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、豚鼠气单胞菌包被酶标反应板，血清采用最适稀释度，检测是否有交叉反应情况。

阻断实验:将107CFU/mL的异常嗜糖气单胞菌菌液包被酶标反应板，将阳性血清从1∶200开始做倍比稀释，各稀释度分别加入等量的异常嗜糖气单胞菌菌液，混匀后于37℃培养箱中放置1h，同时对照是不做任何处理的抗异常嗜糖气单胞菌的阳性血清和阴性血清，进行间接ELISA测定，测定其阻断率。计算其抑制率的公式为(N－T/N)，N是未经处理异常嗜糖气单胞菌的阳性血清的OD492值，T为经过处理的阳性血清的OD492值。

1.4.5 重复性实验

取阳性血清做1∶1000稀释，随机加到酶标板孔中，作间接ELISA测定，酶标仪读值后，计算出平均OD492值与标准差(SD)，之后计算板内变异系数(CV)，公式如下:CV%=SD/平均OD492值× 100%。然后同样血清在随机5块板上，做如上重复测定。然后根据OD492值，计算出每份血清的板间变异系数。

1.5 间接ELISA检测方法的应用

取人工感染试验患肿嘴病的施氏鲟鱼及健康施氏鲟鱼各35条，解剖后将其肝、肾、嘴等组织用5倍体积的无菌PBS匀浆，离心机4000r/min，离心后取上清液60℃1h灭活，放4℃冰箱备用。用间接ELISA程序检测，将离心处理后的上清液直接包被酶标板，100μL/孔，2个平行，以下方法同1.4。

2 结果

2.1 间接ELISA抗原和抗血清最适工作浓度的确定

不同稀释度包被抗原与1∶25000稀释的阳性血清作用所得的OD492值如表1所示，由于抗原在作1∶100稀释时OD492值接近1.0，且P/N值最大，所以确定包被抗原的最适工作浓度为107个/mL。

表1 抗原最适包被浓度的确定

如表2所示，取抗原最适包被浓度1× 107CFU/mL，当免疫血清作1∶10000稀释时，酶标仪读取的OD492值趋近于1.0同时P/N值最大，所以确定免疫血清的最适稀释度为1∶10000。

表2 最适血清工作浓度的确定

2.2 免疫血清敏感性试验结果

以最适稀释度血清(1∶20000)检测抗原灵敏度，结果见表3。从表3可见，用间接ELISA测得免疫血清能检到的异常嗜糖气单胞菌株最低浓度为104CFU/mL。每孔为103CFU。

表3 免疫血清敏感性试验结果

2.3 特异性实验

2.3.1 交叉实验

检测金黄色葡萄球菌、迟钝爱德华氏菌、屈挠杆菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌与抗异常嗜糖气单胞菌阳性血清交叉反应情况，异常嗜糖气单胞菌作对照，结果显示只有异常嗜糖气单胞菌呈阳性，其余细菌均呈阴性(表4)。

表4 免疫血清交叉实验结果

2.3.2 阻断实验

经过异常嗜糖气单胞菌处理过后的阳性血清随着稀释度的增加，由表5可看出，OD492值明显下降，并逐渐接近阴性水平;而未经异常嗜糖气单胞菌处理的阳性血清随着稀释度的增加OD492值缓慢下降。阻断率最高为67.30%，说明该阳性血清对异常嗜糖气单胞菌具有特异性。

表5 免疫血清阻断实验结果

2.4 重复实验结果

板内变异系数(CV)值为0.053，SD=0.0417，平均OD492值为0.7867，CV=5.3%。板间变异系数(CV)值为0.07998，SD=0.01955，平均OD492值为0.7971，CV=1.955%。板内变异系数和板间变异系数均小于10%，说明本批次酶标反应板的吸附性能较好。

2.5 ELISA检测方法的临床应用

患肿嘴病的施氏鲟进行间接ELISA检测，如果如表6所示，阳性检出率为88.6%，而健康施氏鲟鱼的阳性检出率为14.3%。

表6 施氏鲟鱼的间接ELISA检测结果

3 讨论

在施氏鲟幼鱼养殖过程中，主要发生的细菌性疾病有四种，即细菌性败血症、肠炎病、肿嘴病、烂鳃病［9］。其中，由于细菌性肿嘴病与败血症、肠炎病在疾病发生初期鱼体外观上的病症表现相似，不易区分，但致病菌却不同，因此更需要对施氏鲟鱼肿嘴病进期早期诊断，准确判断病原菌，并进行相应的抗菌治疗，以免因误诊而带来不必要的经济损失。传统的鱼类疾病诊断方法主要是从鱼患病处分离疑似致病菌，并对该细菌(有可能是几种)的形态特征、生理生化特征等进行分析，需要时间长且工作量大，目前已经不能满足鲟鱼疾病防治的需要，而PCR技术虽然具有特异性好、检测速度快且灵敏等优点，但是费用较为昂贵，对人员的实验技能要求较高，同时所选基因的特异性与重复性也受到主观因素的影响，不太适于基层和临床中的病原快速鉴定，所以限制了该方法在实际中的应用。因此，建立准确、灵敏、快速的诊断方法很有必要［10］。酶联免疫吸附法(Enzyme LinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性免疫反应及酶对底物的高效催化反应作用相结合敏感性很高的试验技术。具有特异性强、敏感性高、操作方便、可重复性强、等优点，比较常用的是ELISA双抗体夹心法和ELISA间接法，经常被应用于水产病害检测、诊断等方面，目前嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌等水产病原菌［11－15］已建立了间接ELISA检测技术，但是施氏鲟肿嘴病的间接ELISA检测方法在国内尚属首次报道。本方法的建立对于施氏鲟鱼肿嘴病的早期诊断，有效预防疾病发生，降低养殖成本有着重要意义。

在鳗鲡病鱼中分离到了该菌——异常嗜糖气单胞菌［16］，导致鳗鲡烂尾、腹腔肿大，解剖后肝肾充血肿大而死亡，且人工感染试验死亡率达到100%。本研究表明此菌在施氏鲟中是首次分离得到，感染试验结果表明该菌可造成施氏鲟鱼肿嘴病的发生。因此在水产养殖中应给予一定的重视。

将该方法流程确定各种准确的参数后，对健康施氏鲟和人工感染肿嘴病并发病的施氏鲟进行检测，阳性检出率分别为14.3%和88.6%，表明该技术能够较好的检测已经被异常嗜糖气单胞菌感染发生肿嘴病的施氏鲟，也能够检测没发病但是携带致病菌的施氏鲟，这对于鲟鱼养殖业的早期诊断有着重要意义。本研究所建立的鲟鱼肿嘴病间接ELISA技术具有特异、快速、准确度高等优点，为施氏鲟幼鱼养殖过程中肿嘴病病原菌的检测提供快速准确的检测方法，并为施氏鲟肿嘴病病原菌的ELISA快速检测试剂盒的研制提供科学依据，具有较强的实际应用意义，对进一步制定该病的防治方法具有重要的指导意义。

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