网箱养殖花鲈体表细菌分离鉴定与感染草鱼的研究*

2015-07-18邓锦松宋海霞中山市神湾镇铭胜养殖场广东中山5846中山市海洋与渔业局渔业技术推广站广东中山58400

江西水产科技 2015年4期

邓锦松宋海霞 (.中山市神湾镇铭胜养殖场，广东中山5846;.中山市海洋与渔业局渔业技术推广站，广东中山58400)

邓锦松1宋海霞2
(1.中山市神湾镇铭胜养殖场，广东中山528462;2.中山市海洋与渔业局渔业技术推广站，广东中山528400)

采用细菌分离纯化方法，从患病花鲈体表分离出了5株菌株。通过生化试验和细菌16SrRNA基因序列测定，5株细菌初步鉴定I为野菊微小杆菌;II为乙酰微小杆菌;III－V为巨型球菌。用5株细菌分别感染健康草鱼，5株细菌均具有致病性。在5个菌株中，巨型球菌对草鱼的危害较大。

鲈鱼;细菌;分子鉴定;16SrRNA

近年来，鱼病发生频繁，尤其是细菌性鱼病的暴发，给养殖户造成了极大的经济损失。为了掌握危害鱼类较大的病菌种类、同种细菌在不同种鱼之间的相互传播规律。

本研究对从患病花鲈体表分离的细菌菌株，通过形态学观察及一系列生理生化试验，并采用16SrRNA基因序列测定，测序结果输入到NCBI中，用BLAST工具，对序列进行同源性对比分析进行鉴定［1］，并把分离的各菌株细菌分别对健康草鱼进行感染试验，观察鲈鱼致病细菌对草鱼产生的影响，验证其致病性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌来源

患病花鲈于2013年5月采自饶平县北部的汤溪水库上游养殖场，从患病花鲈体表分离细菌。

1.1.2 试验动物

来源于同一养殖场的健康草鱼300条。

1.2 菌株分离及细菌形态学观察

用无菌棉签沾取患病花鲈的体表处，分别涂布于营养琼脂培养基上，在27℃恒温箱中培养12h，将长出的不同菌落分别转接培养，直到一个平板中只长有一个菌落［2］。然后将菌株分别接种到LB液体培养基中，并将其放入27℃的恒温摇床中进行摇菌12h，后分别将菌液浓度稀释为1× 10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6进行凃板，培养后对菌落的厚薄、大小、表面、边缘、隆起形状、颜色等情况进行观察并记录。另挑取单菌落接种到营养琼脂斜面上，培养12h后进行革兰氏染色，观察现象并记录结果。

1.3 细菌鉴定

1.3.1 基因组DNA提取

取适量细菌于1ml无菌水的Ep管中，12000r/ min离心5min，吸去上清液，收集菌体。向Ep管中加入600μL裂解液(30mmol/Ltris－HCl，0.1mol/LEDTA，0.1mol/LNaCl，1%SDS，pH8.0)、20μL10mg/mL的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃水浴1h。12000r/min离心5min，取上清液，向上清液中加入饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提后，12000r/min离心5min，取上清液，并向上清液加2倍体积的无水乙醇，冰上放置10min，12000r/ min离心5min，去掉上清液，置室温干燥后，溶于30μLTE缓冲液，－20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增

反应体系如下:10×PCRbuffer5μL;25mol/L MgCl5μL;10uM引物各1ul;模板DNA5μL;Taq酶0.5μL;补足双蒸水至50μL。其中，PCR扩增的引物是由上海生工生物服务有限公司合成的FP (5'－GATTAGATACCCTGGTAGTCCAC－3')和RP (5'－CCCGGGAACGTATTCACCG－3')。反应程序:94℃5min;(94℃30s;55℃30s;72℃1min) x30;72℃5min。

1.3.3 电泳

利用2%琼脂糖凝胶电泳(3V/cm，1.5h)检验总DNA的提取和PCR反应结果。

1.3.4 测序

由上海生工生物服务有限公司完成。

1.3.5 序列分析

利用BLAST工具，对测定的细菌基因序列进行同源性对比分析，从而对细菌菌株进行鉴定。

1.4 细菌的生理生化试验

将花鲈体表的不同菌株分别接种在已制备好的各含有蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉和甘露醇五种糖类的糖发酵管中进行糖酵解试验［3］，在恒温培养箱中培养2～3d后，观察现象并记录结果。按照常规方法对花鲈体表细菌进行糖酵解试验、柠檬酸盐培养基试验、硝酸盐还原试验、尿素分析试验、V－P和甲基红生理生化试验。

1.5 细菌的回复感染

感染试验前将菌株分别接种在制备好的LB液体培养基中，培养12h，用平板菌落计数法［4］测定细菌原菌液中活菌数目，细菌菌株浓度(细菌密度)均为:106～107个/ml。

用于回复感染的健康草鱼平均体长为10～15cm，体重150～200g，分五组，每组50条，同时设一对照组。将纯化的单一细菌菌液以肌肉注射(1 ml/尾)方式感染到试验草鱼胸鳍下的肌肉处，对照组注射相同剂量的蒸馏水。将以上试验鱼置于60×30×28cm㎝的长方形的养鱼箱中，持续充氧，连续观察一周。

图1 部分菌株的菌落形态(注:a为鲈体表II，b为鲈体表III)

2 结果

2.1 菌落外部形态和革兰氏染色结果

将纯化后的培养基取出，对细菌菌落的厚薄、大小、表面、边缘、隆起形状、颜色等进行观察(见图1)。革兰氏染色在油镜下观察(见图2).通过比较外部形态及油镜观察结果，得到5个菌株，其外部形态和革兰氏染色结果见表1。

图2 部分菌落油镜下的细菌形态(注:a为鲈体表II，b为鲈体表III)

表1 细菌菌落形态观察和革兰氏染色结果

2.2 菌株鉴定

对16SrRNA基因部分序列正反方向测序的结果进行拼接，结果输入到NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)中，用BLAST工具，对序列进行同源性对比分析，所得结果见表2。

表25 个菌株与相似序列的菌种名称、登录号及同源性

2.3 细菌的生理生化试验

对五菌株进行的糖酵解及其它生理生化试验，通过实验统计，其结果见表3和表4。

2.4 细菌回复感染

将初步鉴定的5种细菌分别接种到健康草鱼，5种细菌对草鱼均治病、开始死亡时间、死亡率、主要症状有不同程度的影响，其结果见图3及表5。

表3 细菌糖酵解试验结果

表4 细菌生理生化试验结果

表55 株细菌回复感染结果

图3 部分菌株回复感染后的症状

3 分析与讨论

本研究用微生物学常用的细菌分离纯化方法，从患病花鲈体表分离出了5株菌株。通过分子生物学鉴定和生化试验，5株细菌初步鉴定I为野菊微小杆菌;II为乙酰微小杆菌;III为巨型球菌HT6;IV为巨型球菌JCSC5402;V为细菌MM5。

在淡水鱼类养殖中，常见的细菌性鱼病主要有烂鳃病、肠炎病、败血症和赤皮病等。在草鱼细菌引起的疾病研究中，祖国掌(2001)的研究表明，草鱼细菌性疾病，主要为细菌性败血症、细菌性烂鳃病、细菌性肠炎和细菌性综合症等4种，而气单胞菌是草鱼患病的主要条件致病菌［5］。在患病花鲈体内细菌分离与分子鉴定研究中，王庆容(2010)的研究表明，引起花鲈患病的主要致病菌是嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌［6］。目前，有关嗜水气单胞菌引起鱼类及其他水产养殖动物疾病的记载和报道已较多见，在世界不少国家和地区均检出该菌，且已对水产养殖业造成严重危害。同时还可引起鱼类、两栖类、爬行类以及哺乳动物发病［7－10］。但目前未见研究对野菊微小杆菌、乙酰微小杆菌、巨型球菌HT6、巨型球菌JCSC5402和细菌MM5对鱼类和其它动物致病报导，因而本研究从患病鲈鱼体表分离出的5株菌株的鉴定及致病性，为了解和掌握鱼类致病病源菌种类、为以后研究鱼病防治奠定基础。

从患病花鲈体表提取分离的细菌感染健康草鱼，5株细菌均具有致病性，说明这些细菌并不是单一感染致病一种鱼类，能够相互交叉感染，而且每种细菌的致病、致死结果各不相同。从5种细菌回复感染草鱼的结果表明，细菌MM5与巨型球菌HT6，对草鱼的危害较大，感染后2d开始死亡，一星期后死亡率最高。

［1］翟中和，王进喜，丁明孝.细胞生物学(第三版)［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［2］沈萍，范秀荣，李广武.微生物学实验(第三版)［M］.北京:高等出版社.1999.

［3］邵荣标.细菌糖发酵普遍性变异的观察［Z］.中国卫生检验杂志，1998，8(3):176－178.

［4］熊海燕，王为国，王存文，曾东方，赵玉凤.介绍测量菌液的一种方法［J］.四川食品与发酵，2003，4(3):45－46.

［5］祖国掌，余为一，李槿年等.草鱼的几种细菌性疾病及其致病原因的研究［J］.2001，28(3):290－293

［6］王庆容，宋培勇，杨秀荣.乌江网箱养殖中患病花鲈的细菌分离与分子鉴定［J］.2010，3(1):112－115

［7］沈锦玉，陈月英，沈智华等.浙江养殖鱼类暴发性流行病病原的研究嗜水气单胞菌的分离、致病性及生理生化特性［J］.科技通报，1993，9(6):397－401.

［8］陈怀青，陆承平.嗜水气单胞菌:黄鳝出血性败血症的病原［J］.中国人兽共患病杂志，1991，7:21－23

［9］杨臣等.貉嗜水气单胞菌病的诊断［J］.中国畜禽传染病，1992，(63):17－18

［10］陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述［J］.水产学报，1992，16(3):282－286

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