孕马尿中主要结合雌激素的TLC定性鉴别

2015-07-13姚军任丽君李敏等

安徽农业科学 2015年7期

姚军　任丽君　李敏等

摘要为了建立薄层色谱法快速评价新疆孕马尿中结合雌激素品质的方法，将孕马尿样品采用大孔吸附树脂固相萃取进行前处理，薄层板为硅胶G板（20×10 cm），展开剂为乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（30∶90∶22，体积比），显色剂为20%的硫酸乙醇溶液。孕马尿中3种主要结合雌激素在薄层板上呈现蓝绿色斑点，尿中其他杂质无干扰。建立的薄层色谱法能够对孕马尿中主要结合雌激素快速鉴别，可用于孕马尿结合雌激素品质评价。

关键词结合雌激素；孕马尿；薄层色谱法；质量控制

中图分类号S857.2+2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-147-03

女性进入更年期，激素分泌急剧减少甚至不再分泌，激素的减少将严重影响妇女生理及心理健康。如果不予以重视和治疗，将会大大增加更年期症状。雌激素补充疗法作为治疗妇女更年期综合征的方法之一，在预防绝经后骨质疏松[1]、冠心病[2]及阿尔兹海默症[3]方面起着非常重要的作用。怀孕母马的尿液中富含雌激素，每匹孕马在孕期内可形成雌激素50～ 100 g[4]。这些雌激素是一类结构较为相似的甾体化合物，在马尿中它们多以硫酸钠盐形式结合，因此称为结合雌激素（Conjugated estrogens，CE）。其中，雌酮硫酸钠（Sodium estrone sulfate，ES）、马烯雌酮硫酸钠（Sodium equilin sulfate，EqS）及17α双氢马烯雌酮硫酸钠（Sodium 17α-dihydroequilin sulfate， 17α-EqS）是其中最主要的成分，占孕马结合雌激素总含量的90%以上，成为孕马结合雌激素指标性成分。惠氏公司从20世纪40年代就开始从孕马尿中提取结合雌激素，作为更年期妇女雌激素补充疗法的药物，结合雌激素一直作为妇女雌激素补充疗法的主要药物。

新疆地区具有极其丰富的牧业资源，其中伊犁河谷是目前世界上马匹最集中的地区之一，不仅数量多，而且伊犁马的优良品质扬名海内外。根据《新疆统计年鉴（2011）》有关数据[5]可知，截止2010年年底新疆马匹存栏量为85.29万匹，其中伊犁哈萨克自治州为新疆马匹的集中分布区，其马匹存栏量为56.04万匹，占新疆马匹存栏总量的65.71%。目前，已有不少制药企业从孕马尿中提取结合雌激素研发新的雌激素药物，但由于孕马资源属于当地牧户，在收购马尿时需要对孕马尿品质进行评价，因此建立简便易行的检测方法就显得至关重要。目前，已经建立了银化硅胶板分离孕马结合雌激素的方法，但是由于银化硅胶板中的银离子极易氧化，实际操作中仍存在诸多问题，难以实际应用[6]。笔者建立了孕马尿3种主要CE的TLC快速定性方法，可用于孕马尿中结合雌激素品质的快速定性检测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

仪器。薄层色谱仪（包括CAMAG LINOMAT5自动点样器、CAMAG REPROSTAR3成像系统、CAMAG ADC2自动展开系统，瑞士卡玛公司）；AB135-S电子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；高速冷冻离心机（HERAEUS MULTIFUGE X3R，美国Thermo scientific公司）；恒温真空干燥箱（型号DZF-6090，购自上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.2

试剂。ES、EqS及17α-EqS对照品（新疆新姿源生物制药公司提供，含量≥99.0%）；薄层色谱法所用甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷、乙醇、氢氧化钠、氯化钠、硫酸均为分析纯；HPD-400大孔树脂（上海摩速公司）；硅胶G板（20×10 cm）（青岛海洋公司）。

1.1.3

试验材料。

采集的孕马尿样品均来自新疆伊犁州新源县土尔根乡牧户，批号分别为201301、201302、201303、201304、201305、201306、201307、201308、201309，以上9批为怀孕母马尿液；批号分别为201310、201311、201312、201313为未怀孕母马尿液。

1.2方法

1.2.1

3种CE对照品溶液的制备。精确称取ES、EqS和17α-EqS对照品各20.0、10.0和7.5 mg，分别置于100 ml的容量瓶中，加入甲醇-水（50∶50）溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成ES、EqS、17α-EqS的浓度分别为200、100和75 μg/ml的储备液。分别精密量取上述3种对照品储备液2.0 ml置于10 ml容量瓶中，以甲醇-水（50∶50）溶剂定容，得到3种CE浓度分别40、20和15 μg/ml混合对照品溶液。

1.2.2

显色剂溶液的配制。量取200 ml浓硫酸溶液，溶于乙醇中，最终定容至1 L，摇匀后得到浓度约为20%的硫酸乙醇溶液。

1.2.3

孕马尿样品的处理。

1.2.3.1

稀释直接点样。取马尿10 ml，以5 000 r/min离心5 min，取上清液稀释5倍，点样。

1.2.3.2

液液萃取处理。取马尿10 ml，以5 000 r/min离心5 min，取上清液5 ml，加入0.5 g NaCl固体，分别加入10 ml和15 ml乙酸乙酯萃取2次，每次涡旋5 min合并乙酸乙酯层，摇匀，点样。

1.2.3.3

固相萃取前处理。5 ml注射器管，用一筛板置于出口处，取HPD-400大孔吸附树脂1.0 g，干法装填，装填体积约2 ml。

活化方法：先用5 ml无水乙醇活化，然后用5 ml纯水在重力作用下洗脱。

取孕马尿5 ml于高速离心机5 000 r/min离心5 min，准确量取上清液1.0 ml，缓慢滴入固相萃取小柱中，用5%NaCl溶液4 ml清洗，再用1.5%NaOH溶液4 ml清洗，弃去清洗液，再用无水乙醇洗脱并收集流出液至5 ml，摇匀，作为薄层色谱方法供试品，清洗和洗脱步骤均在重力作用洗脱。

1.2.3.4

薄层色谱条件。

薄层板：硅胶G板（20×10 cm）；展开剂：乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（体积比30∶90∶22）；点样量为20 μl，点样宽度3 mm；展开方式：利用自动展开系统，3次增量展开（即展开至硅胶板的1/3、2/3处时取出凉风吹干，放入缸中继续展开）；显色方式：浸入法显色；于105 ℃加热5 min后置于成像系统中紫外灯365 nm处检视。

2结果与分析

2.1 样品前处理方法的考察

分别进行了稀释直接点样、液液萃取、固相萃取3种前处理方法的考察，3种方法处理的样品的TLC图谱见图1～3。