基于16S rDNA-DGGE技术的真空包装鲢鱼片腐败菌群研究

陈慧斌，孙钧政，王梅英，石丽荣，林祥志

(1 厦门海洋职业技术学院 生物技术系，福建 厦门 361012；2 国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门 361005；3 福建农林大学 金山学院，福建 福州 350002)

基于16S rDNA-DGGE技术的真空包装鲢鱼片腐败菌群研究

陈慧斌1，2，孙钧政3，王梅英1，石丽荣1，林祥志2

(1 厦门海洋职业技术学院 生物技术系，福建 厦门 361012；2 国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门 361005；3 福建农林大学 金山学院，福建 福州 350002)

【目的】 对真空和非真空包装不同温度贮藏的鲢鱼片的腐败菌群进行研究，为真空包装冷藏鲢鱼片腐败菌群及货架期的确定提供参考。【方法】 应用16S rDNA V3区变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析方法，研究不同温度(4，10，20 ℃)条件下，真空和非真空包装鲢鱼片的腐败菌群。【结果】 鲢鱼片贮藏终点的微生物具有多样性，真空包装鲢鱼片的主要腐败菌为少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、梭状芽孢杆菌(Clostridiumfrigidicarnis)、乳杆菌(Lactobacillusoligofermentans)；不同温度下假单胞菌属细菌、漫游球菌(Vagococcussp.)和莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)为优势菌；Pseudomonassp.为鲢鱼片特征腐败优势菌。在4 ℃条件下，真空包装对一部分细菌起到抑制作用，鲢鱼片腐败菌群由少食嗜酵母菌、假单胞菌、梭状芽孢杆菌、威尔氏菌属(Weissellasp.)和乳杆菌构成。【结论】 16S rDNA-DGGE技术可以有效揭示真空包装冷藏鲢鱼片腐败菌群结构。4 ℃冷藏和真空包装相结合可改变鲢鱼片菌群结构，同时抑制部分腐败菌，达到延长货架期的目的。

鲢鱼片；真空包装；16SrDNA-DGGE；腐败菌群

鲢鱼是中国的四大养殖淡水鱼之一，具有较高的营养价值，其鲜肉中含蛋白质15.3%～18.6%，脂肪1.5%～2%，灰分1.0%～1.4%，无氮浸出物0.2%～1.7%。国内外学者采用壳聚糖涂膜[1]、冷藏和冷冻[2-4]、天然提取物[5-6]、γ-射线辐照[7]、气调包装[8]等方法保鲜鲢鱼，取得了较好的效果，但关于真空包装对鲢鱼片的保鲜效果尚未见报道。Fan等[4]认为，冷藏和冷冻可以抑制鲢鱼片中微生物的生长；胡永金等[8]研究表明，气调包装能有效抑制冷藏鲢鱼片需氧菌、嗜冷性细菌及大肠菌群的生长。以上研究均采用传统的微生物计数方法探讨了保鲜方法对贮藏鲢鱼片微生物生长的影响，指出保鲜方法对鲢鱼片菌落数量具有明显的抑制作用，但均未对具体腐败菌菌株及其被抑制效果进行深入分析。

变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术是一种新的微生物检测方法[9]，国内外已有关于该方法可有效描述食品中的发酵菌群和腐败菌群的报道[10-14]，但目前DGGE技术在水产品腐败菌群结构分析中的应用研究极少，在鲢鱼保鲜过程中的腐败菌分析尚未见报道。为此，本研究应用DGGE技术，探究真空包装鲢鱼片贮藏终点优势细菌的分布，以期为更好地研究不同微生物对真空包装鲢鱼片品质的影响奠定基础，并为冷却鲢鱼片防腐研究和延长货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 试验材料 鲜活鲢鱼购于福州永辉超市。

1.1.2 主要仪器和试剂 Y-300真空包装机，福州胜龙食品包装机械设备有限公司；GSP-9160MBE恒温培养箱，厦门精艺兴业科技有限公司；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电泳仪，北京六一仪器厂；PCR仪，BIO-RAD公司；Biorad DCode Apparatus DGGE电泳仪，美国Biorad；GelDoc 2000 System凝胶成像仪，美国Biorad；TakaraTaq酶，宝生物工程有限公司；蛋白酶K，德国Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 鲢鱼片处理方法 鲜活鲢鱼去内脏、鳞片及头，然后沿脊线剔骨分成两半，用无菌水洗净，切分，每份取约200 g用灭菌的真空包装袋非真空和抽真空包装，并分别置于4，10和20 ℃下贮藏，每组样品各3袋。取贮藏感官品质败坏的鱼片用于细菌DNA提取。非真空包装20 ℃贮藏(A1)和真空包装20 ℃贮藏(A2)，贮藏腐败时间分别为1和2 d；非真空10 ℃贮藏(B1)和真空10 ℃贮藏(B2)，贮藏腐败时间分别为10和15 d；非真空4 ℃贮藏(C1)和真空包装 4 ℃贮藏(C2)，贮藏腐败时间分别为20 和30 d；同时取新鲜鲢鱼鱼片进行微生物培养(F)，收集培养基上的细菌，用于DNA提取。

1.2.2 细菌总DNA的提取 贮藏终点时取5 g鱼片剪碎，加入40 mL生理盐水，振摇15 min后用4层纱布过滤，滤液10 000 r/min离心10 min，沉淀再用无菌双蒸水洗涤，向沉淀中加入1 mL的TE(Tris-EDTA)和30 μL 50 mg/mL的溶菌酶，37 ℃保温1 h，然后加入100 μL 100 g/L的SDS和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，55 ℃保温1 h。DNA提取参照文献[14]进行，吹干的DNA溶于50 μL TE缓冲液，经1%琼脂糖检测后，-20 ℃条件下贮藏备用。

1.2.3 PCR反应 参考陈慧斌等[15]的方法，采用巢式PCR扩增鲢鱼片中细菌菌群的16S rDNA V3区。第1轮扩增16S rDNA，引物对为8-27f和1492r[15]；第2轮扩增V3区，正向引物为5′端带40GC夹子的5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，即5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG-GGGCACGGGGGG-3′，反向引物为5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′[15]。本试验所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。第2轮V3区扩增以第1轮16S rDNA扩增产物为模板。两轮扩增均需做阴性对照(CK)，用ddH2O代替模板进行扩增。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测，并于凝胶成像仪下拍照。

1.2.4 细菌DGGE分析 鲢鱼片中菌群DGGE分析参照Muyzer等[16]的方法并加以改进。具体方法为：变性胶用0.8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为38%～50%(100%变性剂为7 mol/L尿素和400 g/L甲酰胺的混合物)，试验在Biorad DCode DGGE电泳仪上进行，使用1×TAE电泳缓冲液，上样量为15 μL，在150 V电压和60 ℃ 温度下电泳6.5 h。电泳结束后，将DGGE胶片在SYBR GreenⅠ中染色30 min，之后用凝胶成像仪进行拍照。

1.2.5 条带回收及测序 对DGGE胶上不同迁移距离的单一条带进行回收，最后用50 μL的ddH2O溶解，以此为模板进行V3区PCR扩增。PCR反应体系为：模板1.5 μL，10×PCR 缓冲液2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，上、下游引物各0.8 μL，补ddH2O至25 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测，确认条带后进行DNA回收纯化，经连接转化后送上海生物工程有限公司测序。测序结果登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST软件，将所得的序列与GenBank数据库中的已知序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 细菌V3区PCR扩增

不同包装及贮藏条件下腐败鲢鱼片的细菌总DNA见图1。

以不同温度下贮藏终点的鲢鱼片的细菌总 DNA 为模板，采用巢式PCR，先扩增16S rDNA片段，扩增产物经电泳检测，获得约1 500 bp 的特异性扩增条带(图2)，所有样品扩增条带的亮度均较高。以扩增获得的16S rDNA片段为模板，用V3可变区引物(带40GC夹子)进行16S的V3区扩增，获得约250 bp的特异性扩增片段 (图3)，所有样品均有较亮的扩增条带。说明本试验的 PCR 扩增条件是合适的，可用于后续的DGGE电泳分析。

图1 不同包装贮藏条件下败坏鲢鱼片细菌总DNA的电泳结果M. DNA Marker；A1、A2、B1、B2、C1、C2和F 代表不同包装贮藏条件下的样品。下图同Fig.1 The electrophoresis total microbial DNA extraction from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditionsM. DNA Marker；A1,A2,B1,B2,C1,C2 and F represent the different samples from different packing and storage conditions.The same as the following Fig.

图2 不同包装贮藏条件下败坏鲢鱼片细菌16S rDNA的扩增片段CK. 阴性对照 Fig.2 Bacterial 16S rDNA amplify fragment from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions CK.Negative control

2.2 DGGE图谱及序列测定

DGGE分析结果如图4所示。由图4可以看出，真空包装和非真空包装组鲢鱼片于不同温度贮藏至终点时，条带存在一定的差异。将不同的条带进行编号，切割胶回收DNA，PCR扩增后，经电泳检测，测序比对，结果见表1。由表1可知，除条带7外，其余条带与GenBank数据库已知序列相似性均≥99%，条带7在数据库中与未知菌株GU455092.1的相似度为92%，可能为一新菌株。新鲜鲢鱼片进行微生物培养后，所获得的条带(图1 F泳道)与其他直接提取微生物条带存在一定差异。

图4 不同包装贮藏条件下败坏鲢鱼片细菌DNA的DGGE图谱Fig.4 DGGE profiles of the bacterial community for DNA extracted from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions

2.3 不同包装对菌群的影响

由图4和表1可知，非真空包装鲢鱼片20 ℃贮藏1 d后，可扩增出条带2，3，8，9，12，13，14，16，18和19，分属于普罗威斯登菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、漫游球菌属(Vagococcussp.)、韦荣球菌属(Veillonellaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、黄杆菌属(Flavobacteriaceae)、消化链球菌(Peptostreptococcus)等；该温度下真空包装贮藏2 d，可扩增出条带3，5，9，10，12，13，14，18和19。真空包装在10 ℃贮藏15 d，12和19条带消失，9和10条带变暗，多出条带4和20。真空包装在4 ℃贮藏30 d，条带5，12，18，19消失，表明真空包装低温冷藏对一部分细菌起到抑制作用。真空包装贮藏条件下一直存在的条带有3，9，10，13和14，其分别为少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、漫游球菌属(Vagococcussp.)、乳酸菌(Lactobacillus)。从比对的结果可以看出，条带3，4，9，13和14为4和10 ℃真空包装贮藏后期的主要优势菌，20 ℃真空包装除含有与4和10 ℃真空包装相同的菌以外，还包括条带10，12和18所代表的菌株。条带9和13在所有组贮藏终点都有出现，因此这2种菌为鲢鱼片贮藏终点的优势菌。条带3为真空包装特有的条带，在贮藏终点该条带亮度高，说明少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)为真空包装组的特有优势菌。

表1 不同包装贮藏条件下败坏鲢鱼片各条带主要菌种V3区的比对结果Table 1 V3 region blast results for the major bands strains from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions

注：括号中的数据为最相似菌株V3区的GenBank登录号。

Note:The number in the parentheses was the GenBank accession number for closet relative bacterium V3 region.

2.4 不同温度贮藏条件下菌群的变化

由图4和表1可知，在20 ℃贮藏时，真空和非真空包装条件下的条带有2，3，5，8，9，10，12，13，14，16，18和19，其中条带3，8，9，10，12，13和14较亮，为主要菌群。对比非真空包装10与20 ℃条件下贮藏的鲢鱼片，其微生物菌群发生了变化，条带12(韦荣球菌)、16(黄杆菌)、19(消化链球菌)消失或减弱，10 ℃贮藏后出现了条带7、10，分别为不可培养菌和梭状芽孢杆菌。4 ℃贮藏的非真空包装鲢鱼片，条带3，5，10，12，16和19消失，出现条带1、11和15。不同温度贮藏及不同包装的鲢鱼片贮藏终点微生物多样性的变化，说明不同温度下贮藏鲢鱼片的腐败菌群是不一样的。不同温度下贮藏都存在假单胞菌(Pseudomonassp. LB184) 、漫游球菌属(Vagococcussp.)和莓实假单胞菌(PseudomonasfragiJCM 5475)。

3 讨论与结论

本试验结果表明，不同温度和包装条件下贮藏腐败鲢鱼片的细菌菌群具有多样性，低温贮藏鲢鱼片菌群种类相对于常温贮藏条带少，低温和真空包装可以改变贮藏鲢鱼片的菌群结构。真空包装条件下，鲢鱼片都存在少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、漫游球菌属(Vagococcussp.)细菌和乳酸菌(Lactobacillus)，这些菌为真空包装鲢鱼片的优势菌。江芸等[17]报道，在真空包装条件下猪肉的优势菌为漫游球菌属(Vagococcussp.)细菌，本研究只在真空包装鲢鱼片中发现该菌，说明该菌也是真空包装鱼片的优势菌。

鲢鱼片在不同温度下贮藏都存在假单胞菌(Pseudomonassp.LB184)、漫游球菌属(Vagococcussp.)细菌和莓实假单胞菌(PseudomonasfragiJCM 5475)，表明这些菌为鲢鱼片的特定腐败菌。假单胞菌属被认为是低温贮藏水产品的优势菌属[18]，在冷却猪肉中其也为优势菌属[10]。Cao等[19]也报道，牡蛎冷藏时，温度越低，假单胞菌属细菌所占的比例越大，在冷藏终点时为优势菌属。与许振伟等[20]报道鲤鱼有氧冷藏终点的腐败菌为腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)不同，本试验中未发现这2种腐败菌，这可能是鱼片腐败菌种类受鱼的种类和饲养环境等影响而存在差异所致。

在4、10和20 ℃下贮藏时，条带9都较明亮，且在新鲜鲢鱼片中也存在该条带，说明其所代表的菌属是鲢鱼片的主要菌属，且在贮藏过程中成为优势菌属。本研究在4 ℃贮藏的非真空包装和真空包装鲢鱼片中也都检出条带9代表的假单胞菌，且非真空包装组条带较为明亮，而在该温度下真空包装样品中Pseudomonassp.UA-G006和PseudomonasfragiJCM 5475条带基本不存在，说明真空包装条件下这2种假单胞菌不容易成为优势菌。因此，真空包装对假单胞菌的抑制作用与假单胞菌株种类有关。

本试验中，鲢鱼片在4和10 ℃控温及真空包装的条件下贮藏，在一定程度上改变了鲢鱼片的菌群结构。采用4 ℃真空包装可以明显抑制一部分引起鲢鱼片腐败的细菌，从而延长了鲢鱼片的保鲜期。

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Characterization of bacterial flora in vacuum package sliced silver carp based on 16S rDNA-DGGE

CHEN Hui-bin1,2, SUN Jun-zheng3,WANG Mei-ying1,SHI Li-rong1,LIN Xiang-zhi2

(1DepartmentofBiologicalTechnology,XiamenOceanVocationalCollege,Xiamen,Fujian361012,China；2ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen,Fujian361005,China；3JinshanCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

【Objective】 The study explored the spoilage bacteria flora of sliced silver carp under different temperatures,vacuum and air package,in order to provide reference for the study of spoilage bacterial flora and to identify the shelf life of vacuum sliced silver carp.【Method】 16S rDNA-DGGE of V3 region was used to reveal the bacterial flora of vacuum and air package sliced silver carp under different temperatures(4,10,20 ℃) storage.【Result】 DGGE fingerprinting analysis showed that the diversities were observed at the end of storage of sliced silver carp.The spoilage bacterial flora includeZymophiluspaucivorans,Pseudomonassp.,Clostridiumfrigidicarnis,Lactobacillusoligofermentans.Pseudomonassp.,Vagococcussp.,andPseudomonasfragiwere dominant in different temperatures.Pseudomonassp.was the special dominant bacterium in spoilage of sliced silver carp.Vacuum package sliced silver carp stored at 4 ℃ inhibited part of the species of bacteria and the dominant spoilage bacteria wereZymophiluspaucivorans,Pseudomonassp.,Clostridiumfrigidicarnis,Weissellasp.,andLactobacillusoligofermentans.【Conclusion】 16S rDNA-DGGE technology can be used to reveal the spoilage bacterial flora in vacuum package and chilled storage sliced silver carp effectively.Combination of vacuum package and 4 ℃ storage changed the bacterial community and inhibited part of spoilage bacteria,therefore extended the shelf life of vacuum sliced silver carp.

sliced silver carp;vacuum package;16S rDNA-DGGE;spoilage microbial flora

2013-11-28

国家自然科学基金项目(31401564)；福建省教育厅科技项目(JA12418)；国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心开放基金项目(MBRCU201302)

陈慧斌(1981-)，男，福建漳州人，讲师，博士，主要从事水产品加工及贮藏研究。E-mail：vipin_chen@163.com

林祥志(1973-)，男，福建莆田人，研究员，博士，博士生导师，主要从事海洋资源综合利用研究。

时间:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.012

TS254.4

A

1671-9387(2015)04-0157-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.012.html