不同斑蝥素类物质对人肝癌细胞HepG2增殖作用的研究

晏 容，刘 云，朱欣婷，易小飞，刘 流，李晓飞

（1.遵义医学院基础医学院，贵州 遵义563003；2.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义563003；3.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义563003）

不同斑蝥素类物质对人肝癌细胞HepG2增殖作用的研究

晏 容1，3，刘 云2，3，朱欣婷1，3，易小飞1，刘 流1，李晓飞1，3

（1.遵义医学院基础医学院，贵州 遵义563003；2.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义563003；3.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，遵义563003）

目的 观察斑蝥素酸镁、斑蝥素及斑蝥素酸钠3种斑蝥素类物质对人肝癌细胞HepG2的体外抗肿瘤活性。方法 （1）采用磺酰罗丹明染色法（SRB法）检测不同浓度斑蝥素酸镁、斑蝥素及斑蝥素酸钠在体外对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用；（2）使用透射电镜观察2.27 μmol/L斑蝥素酸镁作用于肝癌细胞HepG248 h后细胞超显微结构的变化。结果 （1）斑蝥素酸镁、斑蝥素及斑蝥素酸钠对人肝癌细胞HepG2有明显抑制作用，抑制率随药物浓度的增加而升高，且呈剂量效应关系，其半数抑制浓度（IC50）分别为2.27、5.70、8.41 μmol/L；（2）透射电镜下见核染色质聚集成块附着于核膜下，且见核异形等凋亡细胞形态特征。结论 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2的抑制作用优于斑蝥素和斑蝥素酸钠，且斑蝥素酸镁可以诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。

斑蝥素/类似物和衍生物； 比色法； 肝肿瘤； 免疫组织化学； 染色与标记； 细胞凋亡； 肿瘤细胞，培养的

中药昆虫芫菁体内的斑蝥素被认为是抗癌的主要有效物质，其可治疗原发性肝癌、喉癌、食管癌、宫颈癌等[1]。一直以来人们认为斑蝥素在斑蝥体内的存在形式只有一种游离态，但本研究发现，在斑蝥体内存在游离斑蝥素和结合斑蝥素2种形式[2]，并且常用中药斑蝥（大斑芫菁和眼斑芫菁）体内的结合斑蝥素多数为斑蝥素的盐类衍生物[3]，根据用药的临床经验推测，这些盐类衍生物具有更好的抗肿瘤作用。为了证实这一推测，本研究以提取眼斑芫菁体内的斑蝥素为原料，自主合成了斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钠2种盐类衍生物，并对其体外抗肿瘤活性进行研究，以期获取更好的具有较大价值的抗癌药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物来源 斑蝥素由产自贵阳的眼斑芫菁提取并纯化[4]（纯度大于或等于98%）；斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钠由自制斑蝥素合成而来[5]。

1.1.2 肝癌细胞株 人肝癌细胞HepG2购于中国科学院细胞库。

1.1.3 试剂 RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司），南美胎牛血清、胰蛋白酶（美国HYCLONE公司），磺酰罗丹明（SRB，美国Sigma公司）等。

1.1.4 主要仪器 3131型CO2培养箱、Multiskan spectrum全波长酶标仪（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（日本Nikon公司）；JEM-1400型透射电镜（日本电子株式会社）等。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌细胞HepG2的培养 采用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长至培养瓶底部面积达80%左右，弃去培养液，给予磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，胰酶消化，传代培养。

1.2.2 SRB染色法 将细胞悬液平行接种于4块96孔板中（细胞浓度为8×104mL-1，每孔100 μL），其中1块为对照板，另3块为实验板，培养20 h后，采用50%三氯乙酸（TCA）固定对照板（T0），4℃保存待测。实验板中以加入不同浓度药物（斑蝥素酸镁、斑蝥素、斑蝥素酸钠）组为实验组（T），同时设空白对照组（C）及溶剂对照组。每组有5个复孔，继续培养48 h后取出培养板，依照参考文献[6]方法进行SRB染色。最后在酶标仪上选择530 nm波长测吸光度值（OD值），按照公式计算生长抑制率，肿瘤生长抑制率

1.2.3 不同浓度斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2形态的影响 将不同浓度的斑蝥素酸镁分别作用于人肝癌细胞HepG2，48 h后将其置于倒置显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化。

1.2.4 透射电镜观察斑蝥素酸镁作用后人肝癌细胞HepG2超微结构的变化 于培养瓶中接种2×106mL-1的细胞悬液（每瓶4 mL），37℃、5%CO2培养箱中培养。20 h后弃上清液，再加入配置好的斑蝥素酸镁，药物终浓度为半数抑制浓度（IC50），空白对照组加等量的培养基。培养48 h后收集细胞，依照参考文献[7]方法进行细胞样品处理，最后上机观察。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用 1.25 μmol/L斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2有明显的抑制作用，且随着浓度的增加，其抑制作用更加明显。以药物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标作回归曲线，得方程Y=74.703 ln（X）-11.571（R2=0.972 1）。最终计算得到IC50为2.27 μmol/L。见表1。

2.2 斑蝥素对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用3.31 μmol/L斑蝥素对人肝癌细胞HepG2有明显的抑制作用，且随着浓度的增加，其抑制作用更加明显。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作回归曲线，得方程Y= 71.560 ln（X）-74.595（R2=0.965 3）。最终计算得到IC50为5.70 μmol/L。见表2。

表1 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2增殖的影响（n=5）

表2 斑蝥素对人肝癌细胞HepG2增殖的影响（n=5）

2.3 斑蝥素酸钠对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用 5.25 μmol/L的斑蝥素酸钠对人肝癌细胞HepG2的生长有明显抑制作用，且随着浓度的增加，抑制作用更加明显。以药物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标作回归曲线，得方程Y=64.892 ln（X）-88.328（R2=0.987 0）。计算得到IC50为8.41 μmol/L。见表3。

表3 斑蝥素酸钠对人肝癌细胞HepG2增殖的影响（n=5）

2.4 不同浓度斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2形态的影响 与空白对照组比较，当斑蝥素酸镁浓度为1.25 μmol/L时，细胞数目略减少；当斑蝥素酸镁浓度为1.88、2.50 μmol/L时，细胞数量明显减少，细胞贴壁差；当斑蝥素酸镁浓度为3.13、3.75 μmol/L时，仅剩余少数细胞，并且出现细胞皱缩，体积变小、变圆的现象。见图1。

图1 不同浓度斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2形态的影响（100×）

2.5 透射电镜观察斑蝥素酸镁作用后人肝癌细胞HepG2超微结构的变化 空白对照组肝癌细胞表面有突起，核质比正常，核膜核仁清晰，线粒体、内质网清晰可见（图2A）。2.27 μmol/L斑蝥素酸镁作用于肝癌细胞后，细胞表面突起消失、核异形、核染色质聚集成块附着于核膜下（图2B）。

图2 斑蝥素酸镁作用后人肝癌细胞HepG2超微结构的变化

3 讨 论

本实验采用SRB法进行体外抗肝癌活性筛选，该法已成为美国国立癌症研究所筛选抗癌药物的一种新方法[8]。SRB法是利用蛋白质染色原理，避开了某些肿瘤细胞还原酶活力低下，难以采用噻唑蓝（MTT）比色法这一难题，与MTT法比较，SRB法具有操作时间短、结果稳定、可靠、灵敏等优点[9]，现已成为新一代抗肿瘤药敏试验及其他肿瘤药理学研究的主要实验手段之一。本实验结果显示，斑蝥素酸镁、斑蝥素、斑蝥素酸钠对肝癌细胞HepG2均有抑制作用，其中抑制作用最好的是斑蝥素酸镁，其次是斑蝥素、斑蝥素酸钠。斑蝥素是临床常用药物，具有较好的抗癌效果，但其不溶于水的化学性质制约了其作为注射液的应用，为此，已有研究制备出水溶性好的斑蝥素酸钠用于临床治疗，并且已有斑蝥素酸钠能有效抑制人肝癌细胞增殖的文献报道[10-11]。本实验证实，斑蝥素酸镁对肝癌细胞的体外抗癌活性好于斑蝥素和斑蝥素酸钠，并且斑蝥素酸镁具有一定的水溶性，可以开发成针剂，解决了口服带来的不良反应大、药物吸收少的问题，具有很好的开发潜能。同时，本实验采用透射电镜观察斑蝥素酸镁作用于肝癌细胞HepG2后超微结构的变化，镜下见移植瘤细胞表面突起消失、核异形、核染色质聚集成块附着于核膜下等凋亡细胞形态变化，提示斑蝥素酸镁可以诱导肝癌细胞HepG2发生凋亡。下一步实验将选择更多的人肝癌细胞，进一步考察斑蝥素酸镁对肝癌的抑制作用及其机制，为其研发提供实验依据。

[1]魏方超，杜娟，未宁宁，等.斑蝥素及其衍生物的研究现状与应用[J].现代生物医学进展，2012，12（8）：1586-1589.

[2]李晓飞，陈祥盛，王雪梅，等.芫菁体内斑蝥素的含量及存在形式[J].昆虫学报，2007，50（7）：750-754.

[3]李晓飞.芫菁体内结合斑蝥素与金属元素含量的比较[J].湖北农业科学，2011，50（13）：2762-2764.

[4]李晓飞，陈祥盛，候晓晖.一种斑蝥素分离纯化方法：中国，20071007-7858[P].2010-05-26.

[5]李晓飞.斑蝥素酸镁及其制备方法：中国，201110149288.5[P].2013-04-17.

[6]Vichai V，Kirtikara K.Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening[J].Nat Protoc，2006，1（3）：1112-1116．

[7]胡野，凌志强，单小云.细胞凋亡的分子医学[M].北京：军事医学科学出版社，2002：470.

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Effect of different cantharidin materials on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells HepG2

Yan Rong1，3，LiuYun2，3，ZhuXinting1，3，YiXiaofei1，LiuLiu1，LiXiaofei1，3
（1.BasicMedicineSchool，ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563003，China；2.Medical and Biological Research Center，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To investigate the in vitro anti-tumor activity of three kinds of cantharidin materials magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2.Methods （1）The sulforhodamine B（SRB）assay was employed to evaluate the inhibitory effect of magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2 in vitro；（2）the transmission electron microscopy was used to observe the ultra-structural changes after 2.27 μmol/L magnesium cantharidate acting on hepatocellular carcinoma cells HepG2for 48 h.Results （1）Magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate had obvious inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells HepG2，the inhibitory rate was increased with the medication concentration increase，showing the dose-effect relationship，the half inhibitory concentrations（IC50）were 2.27，5.70，8.41 μmol/L，respectively；（2）the transmission electron microscopy found the morphological features of apoptotic cells，such as the nuclear chromatin was gathered into a block attaching to below the nuclear membrane，heteromorphic nucleus and so on.Conclusion The inhibiting effect of magnesium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2is superior to that of cantharidin and sodium cantharidate，moreover magnesium cantharidate can induce the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells HepG2.

Cantharidin/analogs&derivatives； Colorimetry； Liver neoplasms； Immunohistochemistry； Staining and labeling； Apoptosis； Tumor cells，cultured

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.001

A

1009-5519（2015）21-3209-03

2015-07-20）

国家自然科学基金（81560669）；贵州省科技厅社会发展攻关项目（黔科合SY字[2012]3082）；贵州省科技厅社会发展攻关项目（黔科合SY字[2011]3031）；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目（黔教合KY字[2014]212）；遵义市汇川区科技计划项目（E-114）。

晏容（1978-），女，贵州遵义人，硕士研究生，副教授，主要从事昆虫资源开发与利用的研究；E-mail：yanr3725881994@sina.com。

李晓飞（E-mail：lixiaofei35@gmail.com）。