固相萃取—高效液相色谱法测定焦糖色素中副产物2—甲基咪唑、4—甲基咪唑和2—乙酰基—4—（1，2，3，4—四羟基丁基）咪唑

荣维广 宋宁慧 阮华 吴建 马永建 吉文亮 刘华良

摘 要 建立了固相萃取法结合高效液相色谱同时检测焦糖色素中2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）的方法。样品经加水涡旋提取后，经混合型强阳离子交换固相萃取小柱富集净化，以乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）为流动相，流速为0.6 mL/min，用反向色谱柱Polaris C18-A （250 mm×4.6 mm，5 μm）柱分离，分别在二极管阵列检测器215 nm波长条件下检测焦糖色素中的2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和287 nm波长条件下检测2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑的含量。2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑在0.2～20 mg/L之间线性关系良好（r>0.9996），在10， 25和100 mg/kg添加浓度的回收率范围为75.3%～93.4%，相对标准偏差均小于10%，检出限分别为为2.6， 3.0和1.5 mg/kg，定量限分别为8.5， 10.0和5.0 mg/kg。

关键词 高效液相色谱法； 焦糖色素； 2-甲基咪唑； 4-甲基咪唑； 2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑

1 引 言

焦糖色素是一种食品添加剂（俗称酱色），是一种浓红褐色的胶体物质，占整个食品着色剂销量的90%以上【1】。可应用于酱油、醋、酱菜、啤酒、罐头、糖果、汤料、焙烤食品、烤烟及止咳糖浆等各个方面【2】。在焦糖色素的形成过程中主要发生两大类反应——美拉德反应和焦糖化反应【3】，其中普通焦糖色素的生产过程中主要发生焦糖化反应，生产过程中加入氨（铵）催化剂的焦糖色素生产以美拉德反应为主。研究发现，美拉德反应过程中能够产生许多对人体有害的化学物质【4】，如2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）。2-MEI 和4-MEI作为神经毒素，具有强烈的致惊厥作用，美国国家毒品管理计划和其它研究者已经有明确的毒理学数据证明其具有致癌的风险【5～8】。2011年，国际肿瘤研究机构（IARC）将甲基咪唑类化合物认定为2B类致癌物【9】，而THI可引起免疫毒性【10，11】。鉴于咪唑类化合物的毒性，欧盟委员会已经对Ⅲ类焦糖色素中THI和4-MEI建立了限量规定，分别为10和200 mg/kg【12】。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的检测方法对保证焦糖色素的品质，乃至使用焦糖色素着色的包括食品在内的众多产品的品质尤其重要。

焦糖色素是一种黑褐色粘稠液体或固体，基质复杂。去除大量基质的干扰成为准确分析微量及痕量目标物的关键。目前，针对焦糖色素中4-MEI含量的测定，我国唯有食品添加剂焦糖色卫生标准GB8817-2001【13】，采用薄层法测定，而对于2-MEI和THI的测定尚无国家标准，也没有限量规定。近年来，国内仅见2-MEI和4-MEI的检测方法的报道【3，13～16】，对于THI检测方法研究尚未见报道； 已建立的焦糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的检测方法所采用前处理方法主要有：柱层析【14，15】、液液萃取【16】、离子对萃取【17】、固相萃取【18，19】等。柱层析、液液萃取、离子对萃取操作繁琐，不适合大批量样品分析，且这些前处理方法用于THI提取净化的报道较少。3种目标物的的检测方法主要有薄层色谱法【13】、气相色谱法【14】、液相色谱法【16】、离子色谱法【19】、毛细管电泳法【20】、气相色谱-质谱联用技术【15】和液相色谱-质谱联用技术【18，21】。其中的方法大多数都只能检测2-MEI、4-MEI或THI中的1种或2种物质。

本研究建立了一步固相萃取同时富集焦糖色素中3种目标物2-MEI、4-MEI和THI，HPLC同时检测的方法。与已报道的液相色谱方法相比，本方法的检出限更低，线性范围更宽，操作更简单，准确度更高； 与已报道的液-质联用技术相比检出限相当，操作简单，分析成本更低，适合于对焦糖色素中2-MEI、4-MEI与THI同时检测分析。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与试剂

1200 高效液相色谱仪（光电二极管阵列检测器（DAD），Agilent美国公司），全自动固相萃取仪（北京普立泰科仪器有限公司），氮气浓缩仪（上海安谱科学仪器有限公司），涡旋快速混合器（姜堰市新康医疗器械有限公司），纯水仪（美国Millipore）。水系微孔滤膜（0.22 μm，南京荣华科学器材有限公司）； Oasis MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg，美国Waters公司）； PLEXA PCX（3 mL/60 mg，美国Agilent公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）； HCl（优级纯，含量36%～38%，南京化学试剂有限公司）； 氨水为优级纯（含量25%～28%，南京化学试剂有限公司）； 2-MEI、4-MEI和THI标准品（纯度均≥99.0%，西格玛公司）。

2.2 标准品和标准溶液的制备

标准贮备液：分别精确称取2-MEI、4-MEI和THI标准品0.0125 g（精确至0.0001 g），用水分别溶解并定容至 25 mL，浓度均为0.5 g/L。贮备液置于4 ℃保存。

混合标准中间液：分别吸取 2 mL 的2-MEI、4-MEI和THI标准贮备液于10 mL容量瓶中，用水定容，混匀，其浓度分别为100 mg/L。endprint

标准工作溶液：分别吸取适量标准中间液（100 mg/L）于1.5 mL进样瓶中，用流动相补足到1 mL。配制成2-MEI、4-MEI和THI的浓度分别为0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列混合标准溶液。

2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑

2.3 试样制备 称取焦糖色素样品1 g（准确至0.01 g），加水超声溶解并定容至10 mL容量瓶中。取0.2 mL上述样品溶液，加入0.1 mL 0.1 mol/L HCl，加水补足到2 mL，涡旋混匀后待固相萃取净化。

2.4 样品分析

2.4.1 固相萃取条件 将制备好的样品溶液加入刚活化好的固相萃取小柱中（1 mL甲醇和1 mL水活化），上样时控制流速小于0.5 mL/min，抽干，加入1 mL水和1 mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，用3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脱收集，控制流速小于0.5 mL/min，抽干。将收集液在低于50 ℃条件下，氮气吹干，残渣用1.0 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过0.22 μm水系微孔滤膜，滤液供HPLC测定。

2.4.2 液相色谱条件 色谱柱： Agilent Polaris C18-A色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）； 流速：0.6 mL/min； 柱温：30 ℃； 进样量：10 μL； DAD检测器检测波长：2-MEI和4-MEI为 215 nm； THI为287 nm。

3 结果与讨论

3.1 流动相和流动相比例的优化

甲醇和乙腈是反相色谱中常用的溶剂，但甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度，而乙腈截止波长比甲醇低，更适合此次实验所用的215 nm检测波长，所以本研究选择乙腈为流动相。

考察了乙腈比例分别为5%， 10%， 20%， 40%的情况对峰形的影响，结果在10%条件下峰形最好，故选择流动相比例条件为乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）。

3.2 固相萃取条件的优化

3.2.1 固相萃取柱的选择 比较了两种阳离子交换SPE（Solid-phase extraction）柱：Waters Oasis MCX（3 mL，60 mg，Waters公司）和Agilent PLEXA PCX（3 mL，60 mg，Agilent公司）的萃取效率。采用2 mL的上液量（分别含有0.5， 2.0和10.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），过柱后分别以3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脱，氮气吹干后检测2-MEI、4-MEI和THI的含量； 与添加量作比较，得出2-MEI、4-MEI和THI在两种类型固相萃取柱的回收率。由表1可知，2-MEI， 4-MEI和THI在Oasis MCX固相萃取柱上的萃取效率略好。

3.2.2 固相萃取上样液酸度的优化 强阳离子交换固相萃取对上样溶液的pH值有要求。本实验比较了0.02和0.1 mol/L HCl溶液调节上样溶液pH值：当使用0.02 mol/L HCl调节样品pH值时，个别样品pH值仍较高，可达到4.3，此类样品的目标物的回收率及稳定性均稍差；而当使用0.1 mol/L HCl调节样品pH值时，所有样品pH<3.0，在此pH值下，在所有样品中目标物的回收率及稳定性均稍好。因此，浓度选择0.1 mol/L。

3.2.3 固相萃取洗脱溶剂及洗脱体积的优化

Klejdus等【18】在固相萃取研究中使用了甲醇-5 mol/L HCl（3∶1， V/V）作为洗脱溶液，该洗脱溶剂中由于存在较多水，不仅不容易挥干，并且大量存在的Cl

将腐蚀对仪器设备，这是该方法的致命缺点。本研究采用氨水-甲醇（5∶95， V/V）进行洗脱收集，方法准确度和精密度均能满足要求。

固相萃取中上液量采用2 mL（分别含有5.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），过柱后以氨水-甲醇（5∶95， V/V）进行洗脱收集，每1 mL洗脱液单独收集，共收集5次。氮气吹干后检测洗脱液中2-MEI、4-MEI和THI含量。由表2可见，用3 mL洗脱液洗脱已能得到满意结果，最终确定洗脱溶液体积为3 mL。表2 不同体积洗脱液中2-MEI、4-MEI和THI的含量NDNDNDND： 未检出 （Not detected）。

3.3 方法评价

3.3.1 方法的标准曲线、相关系数及线性范围

在选定的色谱条件下测定混合标准工作液，得到2-MEI、4-MEI和THI的线性方程、相关系数和线性范围。由表3可知，在0.2～20 mg/L 线性范围内，2-MEI、4-MEI和THI均表现出良好的线性关系，相关系数均大于0.9996。图1为2-MEI、4-MEI和THI标准品的色谱图，图2为典型焦糖色样品中的2-MEI、4-MEI和THI添加回收色谱图。

本研究根据3倍信噪比（S/N=3）得到2-MEI、4-MEI和THI的最低检出浓度为0.05、0.06和0.03 mg/L。当称样为1 g时，经本研究确定的前处理方法处理后最终定容到1 mL检测分析，得到2MEI、4-MEI和THI的检出限分别为2.6， 3.0和1.5 mg/kg，根据10 倍信噪比（S/N=10）得到定量限分别为8.5， 10.0和5.0 mg/kg。方法的灵敏度能够满足食品添加剂焦糖色卫生标准GB 8817-2001【13】中规定的4-MEI限量的检测要求及欧盟标准化委员会【12】规定的4-MEI 和THI限量的检测要求。

3.3.2 方法的准确度和精密度 本方法设置10， 25和100 mg/kg 3个加标水平进行加标回收实验，分别选取Ⅲ类焦糖色2份和Ⅳ类焦糖色2份，重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。2-MEI的平均回收率为80.4%～93.4%，4-MEI的平均回收率为80.2%～93.0%，THI的平均回收率为75.3%～84.6%，准确度均较好，相对标准偏差均小于10%，结果见表4。

3.4 实际样品分析

采用本方法对从全国焦糖色素生产厂家和市场流通环节所采集的69份焦糖色素样品，其中包括

20份Ⅲ类样品和49份Ⅵ类样品，分别检测2-MEI， 4-MEI和THI，检出情况见表5。2-MEI共有7份样品检出，均低于100 mg/kg，未包含在表5中； 4-MEI以食品添加剂焦糖色卫生标准GB8817-2001【13】规定的限量200 mg/kg判定，Ⅲ类和Ⅵ类焦糖色素中4-MEI的超标率分别为20%和18%； 对于THI我国尚无限量标准，根据欧盟标准化委员会【12】的规定Ⅲ类焦糖色素限量为10 mg/kg，Ⅲ类焦糖色素中THI的超标率为35%。

References

1 ZHANG Jin-Yun， ZENG Xiang-Yan. Chinese J. Modern Food Science and Technology， 2006， 22（3）： 67-69

张金云， 曾祥燕. 现代食品科技， 2006， 22（3）： 67-69

2 WANG Feng-Yun， PENG Yun-Long， LYU Jin-An， GU Jia-Shan. Chinese J. Chem. Educ.， 2013， 34（7）： 1-2

汪丰云， 吕金安， 顾家山. 化学教育， 2013， 34（7）： 1-2endprint