柴胡对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的干预作用

张 奇,林成仁,李 涛

柴胡对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的干预作用

张 奇,林成仁,李 涛

目的探讨柴胡对自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠干预作用,为临床应用柴胡治疗多发性硬化(MS)提供依据。方法C57雌性小鼠40只,随机分为空白对照组、EAE模型组、泼尼松组[7.8 mg/(kg·d)]和柴胡组[1.95 g/(kg·d)],每组10只。EAE模型组、泼尼松组和柴胡组6周龄时用MOG35-55多肽免疫建立EAE模型,造模后第3天灌胃给予蒸馏水或药物至实验结束。自造模当天观察各组小鼠体重、行为学;造模后第16天(发病高峰期)取脊髓组织行HE染色,观察炎性细胞浸润情况;采取尾静脉血,检测与多发性硬化主要相关炎症因子白细胞介素(IL)17E、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-21、IL-10、IL-23、IL-12(p70)、IL-17A、IL-17F和肿瘤坏死因子(TNF) α水平。结果与空白对照组比较,EAE模型组小鼠发病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高(P<0.05),IL-4水平降低(P<0.05);与EAE模型组比较,发病高峰期泼尼松组外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低(P<0.05或P<0.01),柴胡组IL-17E和IFN-γ水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论柴胡通过抗炎机制减轻EAE小鼠的病情,可作为MS治疗的参考。

自身免疫性脑脊髓炎;多发性硬化;柴胡;泼尼松;炎性细胞因子

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是人类中枢神经系统的自身免疫性疾病,以髓鞘脱失和进行性神经功能丧失为主要特点[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis, EAE)的临床表现、免疫学和病理组织学方面都与MS相似,因而EAE被普遍应用于研究MS临床和病理学特征动物模型[2]。细胞因子参与炎症反应的调节,与MS急性期病情密切相关[3]。由Th1和Th17分泌的γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素(IL) -17已经被检测存在于MS病灶中[4]。尤其IL-17促进炎症发生,可以激活T细胞和其他免疫细胞,产生多种细胞因子、趋化因子和细胞黏附分子。IL-17在EAE的发生发展中起重要作用[5]。而Th2或Treg细胞相关的细胞因子例如IL-4和IL-10可以减轻炎症反应,改善MS患者的症状[6]。柴胡为导师李涛教授治疗MS的常用药物[7],本研究采用C57小鼠EAE作为动物模型,探讨柴胡对EAE小鼠模型的干预作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雌性C57BL/6小鼠4周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号SCXK(京)2012-0001。

1.2 药物 柴胡颗粒(中国中医科学院西苑医院颗粒药房提供),泼尼松片(天津力生制药股份有限公司生产,批号1303040)。

1.3 试剂MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,上海吉尔生化公司合成,纯度98.4%,批号:P130819-XZ051716),百日咳毒素(PT,Catalog Number:P7208,Sigma),灭活结核杆菌H 37RA(100 mg,Lot Number:2072054,Difco),完全弗氏佐剂(F5881-10ml,Lot Number:SLBB1387,Sigma),蛋白液相芯片试剂盒(美国EMD Millipore公司Cat.# MTH17MAG-47K),Mouse Th17 Magnetic bead panel(美国EMD Millipore公司Cat.#MTH17MAG-47K)。

1.4 仪器 Luminex液相芯片检测技术平台(美国EMD Millipore公司),ICE-CL31R低温离心机(美国Thermo公司)。

1.5 动物饲养环境 饲养于中国中医科学院西苑医院实验动物中心动物房。动物饲养条件:温度20℃～ 25℃,标准12h光照/12h黑暗节律,标准饲料和饮水。

1.6 方法

1.6.1 分组与造模 随机分为4组:空白对照组、EAE模型组、泼尼松组和柴胡组,每组10只,适应2周后造模。将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)粉按2 mg∶1 mL比例溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,完全弗氏佐剂加结核杆菌5 g/L,将MOG35-55水溶液与同体积的佐剂混合,充分乳化;50μg PT,用25 mL 0.01 mol/L PBS液溶解,浓度为2μg/mL。每只小鼠注射0.2 mL的乳化剂,MOG35-55注射量为每只200μg。经小鼠背部皮下分3～4点注射0.2 mL抗原配剂。于造模当天、第2天每只小鼠腹腔注射200 ng百日咳毒素。

1.6.2 动物行为学观察 自造模当天起,每天对小鼠进行称重并进行EAE评分。EAE评分标准[8]:0分,无临床症状;0.5分,部分尾瘫;1分,完全尾瘫;2分,失去协调运动和后肢部分瘫痪;2.5分,一侧后肢全瘫;3分,双侧后肢全瘫;3.5分,双侧后肢全瘫伴有前肢力量减弱;4分,双侧前肢瘫痪;5分,死亡。

1.6.3 给药方式及途径 造模后第3天开始灌胃给药,每日1次。泼尼松组予泼尼松7.8 mg/(kg·d)灌胃,柴胡组予柴胡颗粒1.95 g/(kg·d)灌胃,空白对照组和EAE模型组给予等量纯水灌胃。

1.6.4 外周血中主要相关细胞因子的检测 于造模后第16天(发病高峰期)尾静脉采血(n=3)。全血常温静止1 h后,高速离心,取上层血清,-80℃保存。采用Merck Millipore公司的液相芯片Luminex技术,由Milliplex analyst软件进行数据分析。

1.6.5 HE染色 实验动物于造模后第16天(发病高峰期)水合氯醛麻醉后,先以适量生理盐水经左心室冲洗,待冲洗液清亮后,继以4%多聚甲醛灌注固定,然后切取脊髓腰膨大部位浸泡于30%蔗糖后固定液中。石蜡包埋后按5μm厚度连续切片,切片行HE染色。

1.7 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示。多组数据比较采用单因素方差分析,组间两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett T3法。重复测量数据采用重复测量方差分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠发病情况及行为学观察 造模后正常对照组小鼠精神活动正常,体重逐渐增加。EAE模型组(灌胃死亡1只,给予剔除)、泼尼松组、柴胡组发病动物表现精神差、摄食减少、毛色淡暗无光、体重下降、共济失调等。3组造模后以泼尼松组发病最晚,柴胡组略晚于EAE模型组,但差异无统计学意义;以泼尼松组的最高平均评分最低,高峰期持续时间最短,其次为柴胡组,且各组间差异有统计学意义。表明柴胡可以减轻EAE小鼠发病,缩短高峰期发病时间,但作用不及泼尼松。详见表1。

表1 各组小鼠发病情况及行为学评分比较

2.2 发病高峰期中枢神经系统炎症浸润情况 与空白对照组脊髓组织HE染色比较,高峰期EAE小鼠腰髓组织内呈大量的单核淋巴样细胞浸润,可见明显“袖套样”改变。与同时间点的EAE模型组比较,泼尼松组和柴胡组小鼠脊髓组织内的淋巴细胞浸润明显减轻,尤其是泼尼松组接近空白对照组小鼠组织。

2.3 发病高峰期外周血中炎性细胞因子水平的变化

与空白对照组比较,EAE模型组小鼠发病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高,IL-4水平降低,差异有统计学意义;IL-17A、肿瘤坏死因子(TNF-α)有上升的趋势,但差异无统计学意义。IL-10、IL-12p70和IL-23各组间差异无统计学意义。IL-21未能检测出。与EAE模型组比较,发病高峰期泼尼松组外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低,柴胡组IL-17E和IFN-γ水平降低,但降低程度不及泼尼松组,差异有统计学意义。详见表2。

表2 发病高峰期各组外周血中炎性细胞因子水平的变化(±s) pg/mL

表2 发病高峰期各组外周血中炎性细胞因子水平的变化(±s) pg/mL

_____________________________________________组别nIL-17E_______________________________ _IFN-γIL-17F_____________________________________________ IL-4IL-17A空白对照组3193.56±9.911.42±0.273.50±0.710.38±0.030.02±0.00 EAE模型组3296.85±44.121)2.14±0.241)45.32±4.971)0.12±0.031)0.22±0.13泼尼松组3 77.20±13.163)0.48±0.103)5.85±0.772)0.20±0.070.01±0.01 _柴胡组_____________________3___________ _201.41±26.612)4)___0.87±0.173)5)________75.53±13.69_______1.4_______________________________ 9±1.260.05±0.03 _____组别TNFαIL10IL12p70IL23空白对照组1.05±0.151.19±0.086.64±1.2520.02±0.90 EAE模型组3.28±0.851.29±0.122.83±0.136.97±2.64泼尼松组0.80±0.041.08±0.161.64±0.412.14±0.37 _柴胡组5.57±1.181.30±0.041.86±0.2518.27±6.47 _____与空白对照组比较,1)P<0.05;与EAE模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01;与泼尼松组比较,4)P<0.05,5)P<_________________ 0.01。

3 讨 论

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白特定地表达于中枢神经系统髓鞘最外层薄板和细胞上及少突胶质细胞中,是MS脱髓鞘过程的关键性自身抗原,MOG35-55诱导C57小鼠的EAE与MS有着相似临床表现和病理学特征,广泛应用于MS动物实验研究。本实验EAE模型组小鼠行为学表现为:发病时出现体重下降,尾瘫和肢体瘫痪。造模后EAE小鼠发病率在50%左右,个体小鼠最高评分3分,接近文献报道[9]。IL-17家族是近来发现的细胞因子家族,有6名成员分别是: IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E和IL-17F。主要由效应CD4+Th17细胞(Thelper17, Th17)分泌。IL-17 A(即狭义上的IL-17)是最早克隆的IL-17家族成员,与IL-17F一样,主要由CD4+Th17细胞产生。IL-17具有免疫调节、粒细胞募集、介导信号转导等多种作用,在MS患者外周血单核细胞和脑脊液中表达升高[10]。EAE发病前期和高峰期中枢神经系统组织的IL-17mRNA和IL-17水平升高,缓解期下降,IL-17mRNA表达水平与EAE病情呈正相关[11]。IFN-γ是一种重要的细胞因子,主要由Th1细胞产生,促进炎症的发生。Simpson等[12]观察到IFN-γ对MS复发有很强的影响力,增加IFN-γ可以明显增加MS的复发率。通过对脾细胞分泌的细胞因子mRAN表达水平检测发现:在第1次发病时,脾细胞分泌IFN-γ增加,其mRNA表达水平升高[13]。显示IL-17和IFN-γ在MS和EAE发病中起着重要的作用。IL-4是天然CD4+T细胞向Th2细胞分化的关键,可以减轻炎性脱髓鞘疾病病情[14]。本实验通过对各组小鼠外周血中细胞因子水平检测,发现发病高峰期EAE小鼠外周血中IL-17E、IL-17F和IFN-γ水平升高,IL-4水平降低;泼尼松降低小鼠发病高峰期外周血中的IL-17和IFN-γ水平抑制炎症反应,柴胡可降低外周血中IL-17E和IFN-γ水平减轻炎症反应,但强度不如泼尼松。

造模3组中以EAE模型组发病最早,病情最重,柴胡组与EAE模型组相比发病稍晚,病情较轻,但柴胡组作用次于泼尼松组。临床上糖皮质激素通常用于MS急性发作期治疗,但长期使用糖皮质激素治疗MS疗效目前并不确定,且可导致严重副反应[15]。柴胡及其复方制剂可以作为治疗的选择之一。

柴胡味苦,性微寒,归肝胆经,具有和解表里、疏肝、升阳的作用,是疏肝解郁代表药物。李涛教授认为多发性硬化与肝关系密切,MS症状表现多样,肢体抽搐和共济失调都与风邪亢盛有关。《内经·病机十九条》:“诸风掉弦皆属于肝”;肝为将军之官,主疏泄,调畅一身之气。MS患者因久受病痛之苦,多伴有肝气郁结,故从肝论治,采用疏肝健脾益髓方治疗MS,柴胡是其中重要药物[4]。现代药理学研究柴胡具有解热、镇静、镇痛、抗炎等作用[16]。柴胡主要化学成分为皂苷类、黄酮类、挥发油类、多糖类及其他类化学成分,研究表明柴胡皂苷类有显著的抗炎效果,对多种炎症过程包括炎性渗出、毛细血管通透性升高、炎性介质释放、白细胞游走等均有抑制作用[17]。本实验从动物行为学和组织病理学证明柴胡对于EAE模型小鼠病情有一定缓解作用,抗炎作用是干预的主要途径。

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Intervention Effect of Chaihu on Inflammation in Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Zhang Qi,Lin Chengren,Li Tao
Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China Corresponding Author:Li Tao

ObjectiveTo explored the effect of Chaihu for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE),and to provide laboratory evidence for clinical application of Chaihu treating multiple sclerosis.MethodsC57 mice were immunized by MOG 35-55 to establish EAE,the model of multiple sclerosis.Forty mice were divided into blank control group,EAE model group,predn-i sone treatment group and Chaihu treatment group,which

oral administrations of different drugs after immunized 3 days.The mice behavior,checked daily and graded on clinical score were observed.It had been observed that cytokines levels of peripheral blood,relating to multiple sclerosis major factors,and inflammatory cell infiltration in spinal by HE staining after immunized 16 days.ResultsCompared with control group,the level of interleukin(IL)17E,IL-17F,interferon(IFN )-γwere increased while the level of IL-4 was decreased in EAE group(P<0.05).Compared with the EAE group,the level of IFN-γand IL-17E significantly reduced in Chaihu group.The difference has statistic significance(P<0.05 orP<0.01).ConclusionChaihu has theapeutic effect on the EAE mice by anti-inflammation.

experimental autoimmune encephalomyelitis;multiple sclerosis;Chaihu;prednisone;cytokines

R744 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.019

1672-1349(2015)06-0760-04

2014-12-06)

(本文编辑郭怀印)

中国中医科学院西苑医院(北京100091)

李涛,E-mail:lt0016@263.net