高血压病肝火亢盛证型代谢组学的初步研究

宁 澄,王广基,阿基业,郝海平,陈晓虎,范群丽

高血压病肝火亢盛证型代谢组学的初步研究

宁 澄1,王广基2,阿基业2,郝海平2,陈晓虎1,范群丽1

目的初步探讨高血压病肝火亢盛证型患者的代谢组学变化,并确定其相关生物标志物群,初步阐明高血压病肝火亢盛证型的代谢组学内涵。方法选取2008年8月—2008年12月在江苏省中医院就诊的原发性高血压中医辨证为肝火亢盛证型患者24例,同时选取同期进行体检的健康人群21名,抽取受试者空腹12 h静脉血、留取受试者晨尿。经样品前处理后,采用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF-MS)技术对高血压病肝火亢盛证型患者与健康人群的血清、尿液进行全谱代谢组学分析,并进一步采用主成分分析(PCA)进行主成分因子负荷矩阵分析,并作变量散点图,寻找高血压病肝火亢盛证型相关的生物标志物群。结果高血压病肝火亢盛证型组与健康人群组血清和尿液的代谢谱图均有改变,两组血清代谢谱图差异有统计学意义(P<0.05)。高血压病肝火亢盛证型组与健康人群组血清和尿液的代谢产物中均存在发生显著变化的化合物,并且两组血清中的3-羟基丁酸和葡萄糖,以及尿液中的甘氨酸和磷酸差异均有统计学意义(P<0.05)。结论高血压病肝火亢盛证型患者与健康人群代谢谱之间存在差异,而且可从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢物,阐释中医证候的生物学本质。代谢组学是一种有良好发展前景的中医证候学研究方法。

高血压病;代谢组学;肝火亢盛;中医证型

高血压病是以体循环动脉压升高、周围小动脉阻力增高,同时伴有不同程度代谢障碍为主要表现的临床综合征,是一种危害性极大的疾病。在我国高血压病治疗仍然面临着知晓率低、治疗率低、控制率低的问题。据有关资料统计,目前我国高血压病人数已达1.6亿之多。高血压属中医“头痛”“眩晕”“风眩”的范畴,主要以头痛、失眠、烦躁易怒、乏力为常见症状,晚期因心、脑、肾等脏器出现不同程度的器质性损害而出现相应的各种临床症状,甚至导致患者残疾或死亡。高血压病的病因很多,中医认为情志失调、饮食不节、先天禀赋不足或气血精亏损,均可致阴阳脏腑平衡失调而发为本病。肝火亢盛证是高血压病中的常见证型,也是中医肝病的临床常见证型之一,是某些疾病发展到一定阶段所出现的病因、病理、病位、病势的综合表现。

20世纪90年代中期发展起来的代谢组学(Metabolomics或Metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后的又一门新兴的组学技术,是系统生物学研究不可或缺的重要基础学科之一,通过系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质的科学,具有整体动态、综合与分析等方法学特点,与中医的系统整体观相近。本研究初步探讨高血压病肝火亢盛证型患者的代谢组学变化,并确定其相关生物标志物群,初步阐明高血压病肝火亢盛证型的代谢组学内涵。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年8月—2008年12月在江苏省中医院心内科门诊就诊的原发性高血压患者84例,其中肝火亢盛证型患者24例;选择在体检中心检查的健康人群21名作为健康对照组。高血压病肝火亢盛证型组和健康对照组年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例入选标准 符合原发性高血压西医诊断标准[1]和中医证候诊断标准[2],男性患者,年龄35岁～ 65岁,1周内不同日2次以上测血压,血压达到诊断标准,未用药物,或曾服用药物(包括降压药物)但已停用1周。

1.3 采样及处理方法 抽取受试者空腹12 h静脉血,分离取血清,保存在-80℃冰箱,留取受试者晨尿,统一送至中国药科大学药代动力学重点实验室进行代谢组学测定。

1.4 研究方法

1.4.1 样品处理 血清、尿液样品分别采用4倍和6倍量甲醇沉淀,混匀0℃静置2 h,超速离心、烘干后进行肟化和衍生化处理。

1.4.2 仪器设置 色谱条件选择,质谱(mass spectrometer,MS)检测参数设置需根据实际测定样品过程中相应优化调整。

1.4.3 代谢组谱图处理 首先对谱峰进行基线校正,峰匹配,并用内外标准进行峰面积和保留时间校正后,对谱图按统一标准进行分段积分,如气相色谱/飞行时间质谱(gas chromatography/time of flight-mass spectrometer,GC/TOF-MS)选择400个峰,将积分值和保留指数导入Excel文件,运用SIMCA-P软件进行化学信息学计算,如进行主成分分析(principal component analysis,PCA),获得模式判别和分类结果。

1.4.4 生物标记物的获得及确证 生物标记物的发现与确证是代谢组学研究的目标和重要突破口之一。通过上述分析所获得的代谢指纹图谱,经谱图预处理并积分后,对积分值进行多元统计分析,根据各样本的主成分得分作图,可判别组间差异并对组别进行分类;进一步用分析进行主成分因子负荷矩阵分析,并作变量散点图(Loading plot),从图中可发现显著升高或降低的变量,这些变量的组合即为表征病变的“生物标记物群”,但此时获得的仅为相关峰信息如相应的保留指数和荷质比等。需进一步根据这些信息,进行结构推测,查询相关数据库如NIST谱库以及实验室自建的化合物信息库,必要时运用标准品对比进行结构确证。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理。连续性变量指标做自然对数转换以改善参数分布的正态性,组间比较采用t检验及方差分析,计数资料比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高血压病肝火亢盛证型组与健康对照组血清代谢物数据处理结果偏最小二乘法-判别分析(partial least aquares discriminate analysis,PLS-DA)法得分图(散点越靠近说明样品间差异越小,反之,距离越远,差异越大)显示:健康对照组与高血压病肝火亢盛证型组的样品能明显的被区分开来,差异有统计学意义。详见图1。

图1 两组血清代谢物代谢谱图

模型所对应的这张图上可以找出在两组间有显著差异的峰/化合物/变量(红色方框),上述在两组中差异有统计学意义的变量,右侧正值在健康对照组中浓度高,左侧负值在高血压病肝火亢盛证型组浓度高。详见图2。

图2 两组血清代谢物主成分因子负荷矩阵分析

高血压病肝火亢盛证型组与健康对照组相比,血清标本发生显著性变化的化合物总计有61个,其中被鉴定出的化合物包括:3-羟基丁酸、肌酸酐、尿素、β-D吡喃型葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、甘氨酸、葡萄糖。两组3-羟基丁酸和葡萄糖比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 高血压病肝火亢盛证型组与健康对照组尿液代谢物数据处理结果PLS-DA法得分图显示:健康对照组与高血压病肝火亢盛证型组尿液代谢物差异无统计学意义。详见图3。

图3 两组尿液代谢物代谢谱图

高血压病肝火亢盛证型组与健康对照组相比,尿液标本发生显著性变化的化合物总计有24个,其中被鉴定出的化合物包括:肌醇、反丁烯二酸、奎尼酸、十二甲基五硅氧烷、甘氨酸和磷酸。两组甘氨酸和磷酸比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

血液、尿液是一种含有许多内源性化合物的复杂体液,因此利用高通量、高灵敏的分析手段结合模式识别可以区分疾病模型和正常个体,找出区分两者的内源性化合物,建立疾病经典指标与代谢组学中生物标志物的关系,从而为研究发病机制提供依据。本研究表明在高血压病肝火亢盛证组血清GC-MS代谢谱图的Loading plot中3-羟基丁酸和葡萄糖明显高于健康对照组,而高血压病肝火亢盛证组尿液GC-MS代谢谱图的Loading plot中甘氨酸明显低于健康对照组,而磷酸明显高于健康对照组。

近年来多项实验与研究均支持高血糖可能为高血压的一个独立危险因素。其机制可能有以下几个方面:①高血糖增加糖在近曲小管的重吸收,而伴随钠重吸收,增加体内钠容量(常为10%左右)和细胞外液容量,使血容量增加致血压升高[3]。②血糖与电解质相似,能进入动脉、小动脉壁,引起细胞内水潴留和增加血管反应性,导致周围血管阻力的增加[4]。③交感神经系统的活性可能是血压与血糖相关的一个环节。高血糖时,细胞内被灌注的葡萄糖可增加血管平滑肌对交感神经系统的反应性,使血压升高[5,6]。以上均提示高血糖可能为高血压的独立危险因素,但其确切机制有待探讨。

同时葡萄糖代谢受损(IGM)与心血管疾病危险性高有关联。外周和中心动脉僵硬化增加可能代表葡萄糖耐量状态导致心血管疾病的病理渠道。外周动脉僵硬性随着葡萄糖耐量状态恶化而增加,而此种趋势对中心动脉僵硬性尚不清楚。葡萄糖耐量恶化与中心和外周动脉僵硬性增加有关联,从而可以部分地说明IGM与心血管危险性增加相关联的原因。

甘氨酸即α-氨基乙酸,属于不带电荷的极性氨基酸,是一种非必需氨基酸,含一个氨基和一个羧基,是化学结构最简单的氨基酸,也是人体内一种非必需氨基酸,在中枢神经系统内是一种抑制性神经递质,在其他组织内常被认为功能不明显、仅为合成其他氨基酸提供氮源。然而,近年的研究发现,它还具有抗炎、免疫调节和细胞保护等作用。动物实验表明,它在缺血再灌注损伤、休克、酒精性肝炎、肝硬化、关节炎、急性坏死性胰腺炎、肿瘤和药物中毒等多种疾病中发挥有效的治疗作用。甘氨酸通过直接作用靶细胞或间接调节炎症因子起到细胞保护作用。

目前,关于磷酸及3-羟基丁酸的代谢与高血压发病的关系尚未有明确研究及结果,但对于磷酸代谢及合成产物已经开始展开研究。三磷酸肌醇(inositol 1, 4,5-triphosphate,IP3)是近年来逐渐被关注的一种细胞信号传导分子,在许多病理状态下会发生IP3的改变。Arima等研究证实了IP3有可能通过损伤内皮而与高血压的发生与恶化有关。

中医证候之间存在着代谢产物的不同,这种不同是基于不同证候存在着不同物质代谢或其代谢网络的改变。中医证候的生物学基础研究可从代谢组学研究中找出特异的标志性代谢产物,用生物信息学方法分析生物标志物的功能,来确定“证相关代谢谱群”。而代谢组学技术可以从一个生物样品中检测出数百种低相对分子质量的化合物。这些化合物的相互作用可以和细胞的生物化学和生理学相联系。目前应用代谢组学方法研究高血压的报道还不多,但随着代谢组学研究的深入及其广泛应用,进一步将蛋白质组学与代谢组学的研究有机结合,代谢组学必将在揭示高血压病特异的标志性代谢物,阐释中医证候的生物学本质,乃至进一步阐明高血压的病因机制和发生发展规律,早期诊断预防及个体化治疗中发挥更大的作用。

参考文献:

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R544.1 R255.3

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.005

1672-1349(2015)06-0717-04

2014-10-16)

(本文编辑郭怀印)

江苏省自然科学基金项目(No.BK2008493)

1.南京中医药大学附属医院(南京210029),E-mail: ningchengnj@126.com;2.中国药科大学药代动力学重点实验室