动脉粥样硬化研究概述

葛均波

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动脉粥样硬化研究概述

葛均波

动脉粥样硬化;基因组学;蛋白组学;炎症免疫机制

葛均波,男,中国科学院院士、教授、博士生导师。1993年毕业于德国美因兹大学,获医学博士学位。现任同济大学副校长,复旦大学附属中山医院心内科主任,上海市心血管病研究所所长,复旦大学干细胞和组织工程中心主任。中华医学会心血管病分会候任主任委员,美国心血管造影和介入学会理事会理事,美国心脏病学会国际顾问。

1987年起从事心血管疾病的临床和科研工作,研究方向为冠心病的发病机制、早期诊断和治疗方案优化。作为项目负责人,先后承担了20余项国家和省部级科研项目,包括:国家863计划(首席科学家)、国家973子项目(2项)、国家十一五科技支撑计划、国家自然科学基金和国家杰出青年基金、211工程重点学科建设项目、985工程重点学科建设项目、卫生部临床学科重点项目、上海市重中之重临床医学中心建设项目等。作为通讯作者发表SCI-E收录论文176篇,主编英文专著1部、中文专著11部。作为第一完成人获得国家科技进步二等奖、国家技术发明奖二等奖、教育部国家科技进步一等奖、中华医学科技二等奖(2项)、上海市科技进步一等奖等科技奖项。

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种古老的疾病,虽然对其发病机制的研究已有百余年,但迄今为止应该说人类对它的认识还远远不够,相关疾病如冠心病和脑卒中严重威胁人类健康,AS仍然是心血管领域公认的研究热点和难点。AS的复杂在于其是一种多因素疾病,多种危险因素和环境作用于复杂的遗传基因背景发病。AS只是一种病理学描述,也是人们对这种疾病的经典认知:血管内膜损伤后脂质浸润,单核巨噬细胞、平滑肌细胞增生和泡沫细胞形成。围绕AS发生及血栓形成这一复杂的生物学过程的损伤反应学说、脂质浸润学说、单克隆学说、感染及炎症反应理论等都有较大进展,但各有侧重、缺乏系统性,有较大的局限性。近十年,随着研究手段的巨大进步,尤其是系统生物学的研究方法,打破了既往着眼于某一细胞、某一分子、某一通路的研究思路,汇聚于疾病本身的发生、发展规律,取得了较大进步,本文将从以下几个方面作一概述。

1 AS基因组学和蛋白组学研究

冠心病的家族聚集性已在大量流行病学和前瞻性队列研究中得到证实,我们所熟知的年龄、高血压、血脂异常、吸烟及糖尿病等传统危险因素,通过作用于个体的易感基因影响着AS的发生发展;早期人们主要通过传统的家系连锁分析和候选基因分析法,发现了涉及脂质代谢、炎症免疫、内皮结构和功能、平滑肌增殖、氧化抗氧化等各种过程的基因与冠心病的发生和发展存在一定关联,极大地深化了对AS的认识。人类基因组计划迅速展开,尤其是高通量基因芯片和基因测序技术迅速发展,使得心血管疾病的基因组学研究取得了重大进步,全基因组关联研究(whol e-genome association studies,GWAS)是目前寻找AS基因位点的最好方法,成功发现了许多先前从未认识的冠心病等AS心血管病的致病或易感基因,确定这些致病/易感基因将为疾病的分子分型、早期预警/分层及个体化干预策略制定提供基础。2007年以来,国外先后有多个研究中心通过GWAS发现染色体9p21.3区域与冠心病或心肌梗死相关,该区域包括两个细胞周期依赖的激酶抑制剂CDKN2A和CDKN2B,编码多个与调控细胞周期、凋亡相关的蛋白,参与AS的发生发展。其中rs1333049和rs10757274两个单核苷酸多态(SNP)相关性最高,通过图谱发现二者具有非常强的连锁不平衡。2012年我国学者对1 515例冠心病患者和5 019例对照人群的基因组DNA进行GWAS分析,随后在15 460例冠心病患者和11 472例对照人群中进行多阶段重复验证,并在8.7万欧洲人群全基因组样本中交叉验证,首次鉴定出2p24.1、4q32.1、6p21.32和12q21.33共4个染色体区域,其遗传变异可显著影响冠心病、心肌梗死的发病风险。同时,还证实了国外报道的6p24.1、6q23.2、9p21.3和12q24.13共4个区域与我国人群冠心病、心肌梗死发病风险相关。此外,一些非编码区基因变异的功能位点也参与AS发生发展。一项研究通过全基因组扫描发现了与血液中胆固醇和三酰甘油水平有关的59个新位点,其中一些不仅与血脂水平相关,而且与冠心病危险相关,拓展了传统的对血脂代谢机制的理解。对个体基因信息的了解,必将推动药物基因组学的发展,最终转化为临床实践中早期诊断、危险评估和个体化治疗的有力工具。然而,我们必须认识到由于GWAS的高成本及假阳性率等缺陷,虽然一期的GWAS能发现较多的SNP,然而大多数SNP都无法通过二期、三期功能验证,仅仅是一个遗传路标的发现,具体的功能机制还需进一步研究确定。

蛋白质组学是功能基因组学重要组成部分,通过比较差异化蛋白探讨AS疾病的发病机制是目前心血管领域的前沿和热点。有研究者利用2DE对颈动脉动脉粥样硬化斑块核心区和周围正常区组织进行蛋白质组学研究,21种差异蛋白被鉴定出,其中热休克蛋白(HSP) 27是第一个在颈动脉斑块分泌研究中发现的具有潜在的AS生物标记物。Slevin等用512份抗体设置阵列探讨与稳定性斑块相比较不稳定性斑块蛋白水平的变化,共有21种蛋白在稳定性斑块中高表达,而肿瘤坏死因子(TNF-α)、缺氧诱导因子1α (HIF-1α)、HSP-40、C反应蛋白(CRP)等在不稳定斑块中过表达。迄今,AS蛋白质组学研究的标本多为颈动脉或主动脉,而冠状动脉因其取材的困难,还没广泛用于蛋白质组学的研究。最近,Bagnato等利用shotgun蛋白质组学技术对冠状动脉粥样硬化斑块进行了研究,通过对冠状动脉血管壁层的激光分离技术,共鉴定出806种蛋白,最终确认了4种在AS疾病进展中发挥作用的重要蛋白,包括:转化生长因子-β (TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生因子(PDGF-β)和基质细胞源性因子-1α(SDF-1α)。然而,这些差异蛋白在AS发生发展中的作用(伴随还是因果)还需要进行更深入的探讨,更为精细的组织分离和蛋白组学技术将为未来的研究提供更为广阔的空间。

2 AS的炎症免疫机制

炎症免疫反应在AS病理发生尤其是不稳定斑块进展中的作用是近年AS研究的主流方向。炎症免疫反应被认为是AS发病理论学说的汇聚点。尽管AS发生的原因可以是多方面的(脂质代谢异常、血流动力学负荷、遗传和感染等),但所导致的是一条相似的发展途径,即慢性炎症免疫病理过程。正常动脉内膜下散在分布着一些由免疫活性细胞(主要是单核、巨噬细胞)和树突状细胞构成的细胞群,形成血管相关性淋巴样组织(VALT),VALT功能与黏膜相关性淋巴样组织类似,主要是监测其所在微环境以发现潜在有害抗原,这些抗原作用于VALT,使之失衡,最终激活T淋巴细胞,引起一系列特异性细胞免疫和体液免疫反应。近年来多种AS相关抗原相继被人们所认识,如热休克蛋白60、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、CRP、糖基化终末产物等可于斑块和循环中检测到;在AS病变各个阶段都能观察到T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK),激活的淋巴细胞可通过细胞因子如TNF-α、干扰素(IFN-γ)进一步放大炎症反应,并进一步激活巨噬细胞、血小板和平滑肌细胞,从而导致炎性产物的暴增,促进AS进展和斑块的破裂。其中有多种炎症免疫细胞、细胞因子共同参与、相互联系,构成复杂的网络,并导致AS斑块呈现稳定与不稳定交替出现的现象,涉及多个与炎症细胞趋化、细胞增殖与凋亡、细胞外基质重塑、炎症因子释放相关的信号转导机制都是目前研究的热点;此外,T淋巴细胞的激活首先需要抗原的递呈,目前的AS炎症免疫理论认为给T淋巴细胞呈递抗原的主要是巨噬细胞或B细胞,而二者的抗原递呈功能相对较弱,因此,近年来体内功能最强大的专职抗原递呈和免疫调节细胞-树突状细胞在AS免疫发病中的作用受到了广泛关注,而树突状细胞与调节性T淋巴细胞构成的负向及正向免疫调控网络研究、miRNA在其中的调控机制也是目前研究方向。

3 免疫治疗研究

AS的免疫炎症机制的进展直接促使了免疫治疗的快速发展,也是目前非感染性疾病中疫苗研究和开发最为迅速的方向之一,逐渐成为AS防治领域的新热点。已经证实的参与AS免疫应答的抗原主要包括两大类。①内源性的自身抗原:如ox-LDL、热休克蛋白、β2糖蛋白-I(β2GPI)。②外源性的感染抗原:流感病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。免疫细胞识别和吞噬AS的相关抗原,激活固有免疫应答,并诱导以T淋巴细胞活化为中心的适应性免疫应答,从而启动AS的炎症免疫级联反应。目前的疫苗开发主要是针对以上抗原进行。低密度脂蛋白(LDL)相关的疫苗目前主要有丙二醛(MDA)修饰的ox-LDL疫苗、铜离子修饰的ox-LDL疫苗、MDA氧化修饰的载脂蛋白(ApoB100)疫苗及氧化磷脂疫苗,这些疫苗目前在AS模型小鼠、新西兰白兔等动物模型中进行,由于免疫途径、抗原滴度等不同从而对Th1体液免疫、特异性细胞免疫抑制程度也不同,得到的结果存在差异。HSP既具有免疫原性又具有反应原性,是参与AS发生发展的一种重要的自身抗原。有学者采用鼻饲或口服HSP65免疫高脂喂养LDL-/小鼠,发现小鼠主动脉根部的AS面积明显降低,斑块局部巨噬细胞和T淋巴细胞含量明显降低,脾细胞的增殖能力明显降低,抗HSP-65抗体IgG2亚型明显下降,IFN-γ表达明显下降,白细胞介素(IL)4、IL-10表达明显增加。也有学者采用口服HSP60免疫AS小鼠,发现小鼠主动脉窦和颈动脉斑块面积明显降低,可能与诱导小鼠Th1向Th2应答转化从而诱导免疫耐受有关。β2GPI是一种磷脂结合蛋白,近期的研究显示β2GPI是参与AS的重要抗原之一。在人AS斑块中可以检测到β2GPI的高表达,并且多与CD4+T淋巴细胞聚集,在急性冠脉综合征患者血液中抗β2GPI抗体的浓度明显增加。有研究采用不同剂量口服β2GPI的方式免疫高脂喂养的LDLR-/-小鼠,β2GPI各剂量组小鼠主动脉窦斑块的面积明显降低,淋巴结增殖指数明显降低,淋巴细胞对β2GPI的免疫应答被明显抑制。

目前,AS疫苗防治的有效性大多来自于动物实验的证据,临床证据十分有限,现有的证据还存在相互矛盾的结论,未来对于AS疫苗防治的研究还有如下的问题需要解决:①寻找最佳的AS抗原或抗原表位,提供最成功和特异的保护作用;②确定有效的生物学标志物,评价疫苗防治成效;③探讨疫苗发挥保护性免疫的机制,能够从微观角度阐释其作用机制;④疫苗的安全性、作用途径、应用时间、合理的剂量、合适的佐剂等均是需要解决的问题;⑤未来的研究着眼点还应该适应临床的需要,如何诱导斑块的消退、改变斑块组成或增加其稳定性是临床最需要解决的问题。

R541R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.001

1672-1349(2015)06-0705-03

2015-03-02)

(本文编辑郭怀印)

复旦大学附属中山医院,上海市心血管病研究所(上海200032)