根皮素对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响及可能机制

王会，吴汉东，刘政

(辽宁医学院 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121001)



根皮素对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响及可能机制

王会，吴汉东，刘政

(辽宁医学院 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121001)

目的 研究根皮素对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响及可能机制。方法 以人胃癌细胞SGC-7901为研究对象，检测不同浓度根皮素(40、80、160 mg/L)对细胞的影响，包括细胞形态学分析、细胞活力检测、流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期、线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的变化。结果 不同浓度根皮素处理细胞24 h后，人胃癌细胞SGC-7901发生凋亡形态改变；不同浓度根皮素对SGC-7901细胞有抑制增殖作用和诱导凋亡作用；能将细胞周期阻滞于G1期；细胞线粒体膜电位降低；细胞内钙离子浓度增大，呈时间和浓度依赖性。结论 根皮素可通过阻滞细胞周期进程，降低线粒体膜电位，干扰胞内钙离子稳态来诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡。

根皮素；胃癌细胞；细胞凋亡；细胞增殖

根皮素是存在于苹果、梨等水果及多种蔬菜汁液中的天然活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗菌以及雌激素样作用等活性。根皮素能激活蜂窝蛋白激酶，能抑制细胞无序增殖，具有抗诱变功能，可用于多种肿瘤的治疗[1-2]。根皮素可通过抑制糖的跨膜运输来促进小鼠肿瘤B16-4A5细胞凋亡[3]。根皮素可以嵌入 DNA 分子中，干扰 B16 肿瘤细胞 DNA 复制，使细胞中蛋白激酶 C (protein kinase C，PKC)的活性受到抑制，从而促进细胞凋亡[4]。胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，具有发病隐匿、早期临床症状不明显，早期诊断率低等特点, 绝大多数患者一经发现已处于临床晚期，严重威胁患者的生命和健康[5]。迄今为止，胃癌的发病机制并未完全阐明，不能满足临床对胃癌实施有效的预防及治疗，因此，胃癌的预防及治疗仍然是临床上急需解决的问题。目前关于根皮素诱导胃癌细胞凋亡的研究非常少。本实验旨在以人胃癌细胞 SGC-7901 为研究对象，探讨根皮素对其增殖和凋亡的影响，为胃癌的预防及治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞 SGC-7901 细胞株购于中科院细胞库提供；根皮素(纯度：99.99%；批号：P7912-100MG)；甲基噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、溴乙锭(EB)、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma 公司；RPMI1640培养基和胎牛血清购于GIBCO公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection试剂盒购于BD公司；Caspase酶活性试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器 FC500流式细胞仪(BECKMAN)；TE2000-E激光共聚焦显微镜(Nikon)；IX-71倒置相差显微镜(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 药物配制：根皮素用DMSO(终浓度小于0.5%)溶解，再用基础培养基稀释成浓度为8 mg/mL的母液，分装，置-20 ℃冰箱避光保存备用。在实验中DMSO的终浓度要小于0.1%。

1.3.2 细胞培养：SGC-7901细胞用含10% 标准胎牛血清的RPMI1640培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱培养，当培养液颜色变黄时换液，待细胞呈80%～90% 融合后，作传代处理。取对数生长期SGC-7901细胞进行实验。

1.3.3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核：取灭菌的盖玻片置于6孔板中，按1.0×106个/mL接种胃癌细胞1 mL。培养24 h后分别用含有40、80、160 mg/L的根皮素处理细胞，同时设立细胞对照组。继续培养24 h后，轻轻移除上清，用4%多聚甲醛固定细胞，加入5 mg/L的Hoechst33258染色液避光染色5 min，去染色液，滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，将6孔板内玻片取出盖在载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.4 MTT检测细胞活力：取180 μL对数生长期细胞，按1.0×105/mL接种于 96 孔培养板，培养24 h后分别加入40、80、160 mg/L根皮素进行处理，同时设细胞对照组。每组设 8 个重复，继续培养12、24、36、48 h后每孔加入 20 μL 5 mg/mL MTT(PBS溶解)，继续培养4 h，弃上清，每孔加入 200 μL DMSO，摇匀，利用酶标仪在490 nm波长处测量OD值。实验重复3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率：细胞培养和处理同1.3.4。收集各组培养12、24、36、48 h后的细胞，PBS洗涤3次，向沉淀的细胞样品中加入100 μL PBS悬浮细胞，随即加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混匀。避光常温反应10 min，400目筛网过滤，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.3.6 细胞周期检测：细胞培养和处理同1.3.4。收集各组培养12 h后的细胞，调整细胞浓度为1.0～5.0×105个/样品，加入预冷的70% 无水乙醇，4 ℃ 放置12 h。离心弃乙醇，PBS漂洗1次。加入1 mL PI染液，4 ℃ 避光反应20 min。400目筛网过滤，流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.3.7 线粒体膜电位检测：细胞培养和处理同1.3.4。收集各组培养12 h后的细胞，调整细胞浓度为1.0×106个/样品，加入0.5 mL JC-1染色液，在CO2培养箱避光孵育20 min， PBS

洗涤1次，0.5 mL PBS重悬细胞。400目筛网过滤，流式细胞仪检测各组线粒体膜电位情况。

1.3.8 细胞内钙离子浓度的测定：细胞培养和处理同1.3.4。收集各组培养12 h后的细胞，调整细胞浓度至(1～2)×106个/mL。加入Fluo-3/Am至终浓度为8 μM，置5% CO2，37 ℃培养箱避光孵育30 min，期间振荡3次，并设置阴性对照(不加Fluo-3/Am)。离心，去掉多余染料，用无钙缓冲液PBS洗涤2次，无钙PBS重悬至0.5 mL，流式细胞仪上机检测。

2 结果

2.1 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核 对照组细胞核呈卵圆形，染色质均匀着色，分布于整个细胞核，荧光强度较强。根皮素各浓度处理组细胞染色质凝聚、断裂，呈点状，着色不均匀呈亮点状。见图1。

图1 各浓度根皮素处理SGC-7901 24 h后的Hoechst33258 染色结果(×100)Fig.1 Morphology of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin stained by Hoechst33258(×100)

2.2 细胞活力检测 MTT检测结果显示：根皮素处理 SGC-7901细胞 12、24、36、48 h后，随着根皮素浓度的增大活细胞数量逐渐降低，呈现量效和时效关系。

表1 根皮素对SGC-7901细胞生长的影响Tab.1 Inhibition effect of phloretin on SGC-7901 ±s, n=8)

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，compared with control group

2.3 各组细胞凋亡率测定结果 流式检测结果显示：随着根皮素作用时间的延长和浓度的增大，细胞凋亡逐渐增多，且呈时间依赖性和浓度依赖性。见表2、图2。

组别细胞凋亡率(%)12h24h36h48h对照组3.20±0.885.71±1.258.11±1.579.56±1.49根皮素40mg/L4.23±1.38*9.30±1.39**20.15±1.46**27.00±1.43**根皮素80mg/L6.49±1.53**21.66±2.24**31.20±2.49**30.38±3.59**根皮素160mg/L11.53±1.67**27.33±3.42**35.99±3.29**41.23±3.19**

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较， compared with control group

图2 根皮素SGC-7901细胞凋亡的影响(n=3) Fig.2 Apoptosis rate of SGC-7901 after treatment by phloretin(n=3)

2.4 各组细胞周期检测结果 根皮素处理细胞24 h后，随着根皮素浓度的增大，G1期细胞数百分比增大，S期细胞百分比下降，G2期细胞百分比下降，表明细胞经根皮素处理后增殖停滞在G1期，细胞的DNA合成受到阻滞，且随着根皮素剂量的增加而愈加明显，呈现剂量依赖性。见表3。

表3 根皮素对SGC-7901细胞周期的影响Tab.1 Cell cycle of SGC-7901 cells treatment by phloretin ±s，%, n=3)

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较， compared with control group

2.5 细胞线粒体膜电位的检测 采用JC-1标记流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，结果表明经不同浓度根皮素作用24 h后的SGC-7901细胞的线粒体膜电位下降，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 根皮素对SGC-7901细胞线粒体膜电位变化情况**P<0.01，与对照组比较Fig.3 Mitochondrial membrane potential of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01,compared with control group

2.6 细胞内钙离子浓度的测定 由结果可知：随根皮素浓度增大，细胞内Ca2+浓度逐渐升高，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 根皮素对SGC-7901细胞胞内Ca 2+浓度的影响*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较Fig.4 Concentrations of intracellular calcium of SGC-7901 cells after 24 htreatment by phloretin*P<0.05,**P<0.01,compared with control group

3 讨论

根皮素是一种具有治疗肿瘤功能的多酚类天然化合物，可抑制肿瘤细胞生长, 诱导肿瘤细胞凋亡[6]。根皮素能够通过抑制Ⅱ型葡萄糖转运蛋白来诱导肝癌细胞凋亡[7]。根皮素能通过线粒体途径诱导肝癌细胞 BEL-7402凋亡，还可通过干预与肝癌细胞侵袭力密切相关的细胞粘附、运动及侵袭等作用抑制肿瘤细胞转移潜能[8-9]。

研究认为肿瘤是一种细胞周期性疾病，细胞无限增殖，周期失控导致细胞恶性转化和肿瘤形成[10]。根皮素分子结构中具有 4 个羟基，与葡萄糖结构相似，与葡萄糖运输形成非竞争性抑制，抑制能量来源，促使细胞发生凋亡。根皮素为芳香环结构，可插入到 DNA双螺旋分子中，从而阻止 DNA 合成，影响细胞周期的分布，诱导细胞发生凋亡。

本研究结果表明，经根皮素作用的SGC-7901细胞发生了G1期阻滞，且细胞增殖被抑制。随着根皮素浓度的增加，G1期细胞增加，S期细胞减少，呈现浓度依赖性关系。推测根皮素通过影响细胞周期的分布促凋亡作用，这为开展根皮素诱导胃癌细胞凋亡机理的研究提供了实验依据。

细胞凋亡与线粒体密切相关，线粒体在细胞凋亡的过程中起着重要作用，多种细胞凋亡因素可诱导细胞发生凋亡，在受到凋亡诱导后膜通透性增大，跨膜电位下降，这些是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征出现之前。利用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化，其机制为线粒体存在内负外正膜电位。根皮素是一种解偶联试剂，可以抑制线粒体的氧化磷酸化作用[11]，ATP合成受阻，能量缺乏，促使细胞凋亡。本实验采用 JC-1标记结合流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，发现经根皮素作用后的 SGC-7901细胞，线粒体膜电位降低。推测根皮素诱导SGC-7901凋亡与细胞凋亡线粒体途径有关。

在正常细胞中，Ca2+主要与蛋白质结合封存在内质网和线粒体中，游离的 Ca2+很少，只是在收到外界刺激时才被释放出来充当信号分子。游离 Ca2+在细胞内的过度积累可以直接导致细胞凋亡的发生[12]。当根皮素诱导SGC-7901细胞凋亡时，细胞质内游离钙离子浓度升高，Ca2+稳态发生变化。结合线粒体膜电位降低的结果推测与内质网上钙离子的释放有关，但其具体的机制有待进一步的研究。

根皮素通过抑制细胞DNA合成，降低线粒体膜和干扰钙离子稳态来诱导 胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡。根皮素诱导肝癌细胞凋亡及其机制有待进一步探讨。

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(编校：谭玲)

Effects of proliferation and apoptosis of phloretin on human gastric cancer cells SGC-7901

WANG Hui, WU Han-dong, LIU Zheng

(College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the proliferative and apoptotic effects of phloretin on gastric cancer cell andthe possible mechanisms.MethodsSGC-7901 were treated with different concentrations of phloretin(40,80,160 mg/L), and the cell morphological alterations were detected by using Hoechst33258 staining, cell activity were detected by MTT assay, cell apoptosis, cell cycle progression, mitochondrial trans-membrane potential and intracellular calcium homeostasis were detected by flow cytometry.ResultsAfter treated with different concentrations of phloretin at different times, SGC-7901 cell showed morphological alterations. Phloretin could inhibite the proliferation of SGC-7901 cell line, and induced its apoptosis in a dosage and duration dependent manner. Cell cycle was arrested at G1 phase, mitochondrial trans-membrane potential dropped, intracellular free Ca2+increased.Conclusionphloretin can induce apoptosis of SGC-7901 via arresting cell cycle progression, reducing mitochondrial trans-membrane potential and disturbing intracellular calcium homeostasis.

phloretin; gastric cancer cell; apoptosis; proliferation

王会，男，博士，讲师，研究方向：细胞凋亡，E-mail: yxlwhx077@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)08-0034-04