大黄素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制研究

毕月，隋佳琪，乔瑞红，谢明杰

(辽宁师范大学 生命科学学院 辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)



大黄素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制研究

毕月，隋佳琪，乔瑞红，谢明杰Δ

(辽宁师范大学 生命科学学院 辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 研究大黄素对MRSA41577菌株细胞膜、蛋白质和核酸的影响，探讨其对MRSA的抑菌作用机制。方法 采用TTC法测定大黄素对MRSA41577的抑制作用；检测细胞电导率和大分子含量确定大黄素对MRSA41577细胞膜的影响；SDS-PAGE检测大黄素对MRSA41577可溶性蛋白的影响；DAPI染色法测定大黄素对MRSA41577核酸含量的影响；紫外吸收光谱分析法检测大黄素与DNA的相互作用方式。结果 大黄素对MRSA41577菌株具有显著的抑制作用，其最低抑菌浓度为8 μg/mL。8 μg/mL的大黄素作用菌体6h，与对照组相比，细胞大分子和电导率分别增加了(71.48±0.026)%(P<0.01)和(2.39±0.102)%(P<0.05)。8 μg/mL的大黄素作用菌体16 h，菌体可溶性蛋白的含量与对照组相比降低了32.8%(P<0.01)，DNA和RNA含量分别降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)和(6.67±0.36)%(P<0.05)。紫外吸收光谱结果显示，大黄素可与DNA发生结合，其结合方式为氢键结合。结论 大黄素对MRSA的抑制作用机制主要是破坏菌体细胞膜，通过氢键结合干扰DNA的复制和转录，进而抑制蛋白质的合成，从而破坏菌体的生物学功能。

大黄素；MRSA；抑菌；机制

抗生素的滥用使得耐药菌株大量出现，其中以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin Staphyloccocusn aureus，MRSA)在临床上最为普遍，有“超级细菌“之称。MRSA可在人源和动物源细菌间传播，给临床治疗带来极大的麻烦[1]，因此寻找高效、无毒、不易产生耐药性的抑制MRSA的药物成为当前研究的热点。目前从中药中筛选抗MRSA的药物是主要的来源之一。大黄素是中药大黄的有效单体，主要来源于蓼科植物掌叶大黄、虎杖的根茎和根中。近年来的研究结果显示，大黄素具有广泛的生物学活性，包括抗肿瘤作用、免疫调节作用、抑菌、促进肠道蠕动等活性[2]。本实验室之前的研究结果显示，大黄素能抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，具有抗凋亡作用，且对机体的免疫系统有明显的促进作用[3]。已有的研究结果显示，大黄素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等都具有较好的抑制作用[4-6]。但目前关于大黄素对MRSA的抑制作用研究较少，因此本文通过测定大黄素对MRSA41577菌株的细胞膜、蛋白质和核酸的影响，来阐述大黄素抑制MRSA的作用机制，旨在为开发抗MRSA药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株MRSA41577：由吉林医大二院实验室提供。

1.1.2 主要实验试剂 LB液体培养基、DAPI染料购于上海生工生物工程有限公司。大黄素(纯度≥98%)，购于成都曼斯特生物科技有限公司。pBR322购自宝生物(大连)有限公司。

1.1.3 主要仪器DDS-307A(DDB-600)型电导率仪；UV-1102紫外/可见分光光度计；电泳凝胶定量分析系统(TRANSILLUMZNATOR 2020D)；Cary Eclipse荧光分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 大黄素对MRSA最小抑菌浓度(MIC)的测定：取96孔板，分别加入90 μL MRSA菌悬液(107个/mL)和10 μL浓度为10、20、40、80、160、320 μg/mL的大黄素(终浓度分别为1、2、4、8、16、32 μg/mL)，每个浓度设3个复孔，另以大黄素的助溶剂无水乙醇为对照。于37 ℃ 120 r/min摇床中培养24 h，之后每孔加入20 μL 0.2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，再在37 ℃ 120 r/min避光培养4 h，观察96孔板中液体颜色变化情况。活菌数量越多，则液体红色越深。

1.2.2 大黄素对MRSA大分子和电导率的影响：将培养至对数期的MRSA菌悬液(107个/mL)按2%的接种量加到40 mL LB液体培养基中，加入32 μL浓度为10 mg/mL的大黄素，使其终浓度为8 μg/mL，以大黄素助溶剂无水乙醇为对照组，于37 ℃ 120 r/min摇床中培养。分别在培养0、2、4、6、8 h时取8 mL菌悬液，4500 r/min离心5 min，取上清液，直接用电导率仪测定各组电导率的变化情况。大分子含量测定：取12 mL MRSA二代菌悬液离心，去上清，用PBS洗2次，加入10 mL PBS制成菌悬液，分到2个培养瓶中，每瓶加入15 mL PBS，向其中一瓶加入16 μL浓度为10 mg/mL的大黄素，使其终浓度为8 μg/mL。以大黄素助溶剂无水乙醇为对照组，于37 ℃ 120 r/min摇床中培养。取培养至0、2、4、6、8h的菌悬液3 mL，4500 r/min离心5 min，取上清，UV-1102紫外/可见分光光度计直接测定大分子的变化情况。试验重复3次，取平均值。

1.2.3 大黄素对MRSA可溶性蛋白的影响：将培养至对数期的MRSA菌悬液(107个/mL)按2%的接种量加到20 mL LB液体培养基中，加入16 μL浓度为10 mg/mL的大黄素，使其终浓度为8 μg/mL，以大黄素助溶剂无水乙醇为对照组，于37 ℃ 120 r/min摇床中培养16 h。称100 mg菌体，提取总蛋白，取40 μL蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，采用电泳凝胶系统蛋白分析软件，定量分析各组菌体蛋白质的变化。

1.2.4 大黄素对MRSA中核酸含量的影响：取1.2 mL经8 μg/mL大黄素分别作用14、16、18、20 h的MRSA菌悬液，以加助溶剂无水乙醇为对照组(测定时调整对照组和实验组的OD值一致)。加入3倍体积的DAPI染色液(CDAPI=0.8 μg/mL)。避光振荡10 min，于DNA的激发波长364 nm和RNA的激发波长400 nm下，用Cary Eclipse荧光分光光度计分别测定菌体的DNA和RNA的荧光强度，实验重复3次。

1.2.5 大黄素与DNA的相互作用：于pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中加入1.5 μL浓度为10 mg/mL大黄素，使其终浓度为10 μg/mL，然后分别加入0、0.9、1.5、2.1 μL母液浓度为0.5 μg/ μL的pBR322使其终浓度分别为0、0.3、0.5、0.7 μg/mL，用pH7.4的Tris-HCl缓冲液将反应总体系补为1.5 mL。37 ℃水浴锅中温育30 min后，用紫外分光光度计测定A值。

2 结果

2.1 大黄素对MRSA41577的抑制作用 TTC的染色结果显示，随着大黄素浓度的增加，溶液颜色由红逐渐变浅，表明大黄素对MRSA41577有一定的抑制作用，且呈浓度依赖性。当大黄素浓度>8 μg/mL时，溶液均变为无色，表明大黄素可完全抑制MRSA41577的生长，其MIC为8 μg/mL。见表1。

表1 大黄素对MRSA41577的抑制作用Tab.1 Inhibit effect of emodin on MRSA41577

“+++”为红色，Red；“++”为粉红色，Peach pink；“+”为粉色，Pink；“-”为无色，Colorless

2.2 大黄素对MRSA41577细胞膜的影响 电导率的改变可以反映药物对细胞膜渗透性的影响[7]。实验结果显示，大黄素对培养液的电导率和大分子含量影响显著，8 μg/mL的大黄素作用菌体6 h后，与对照组相比，大分子DNA和RNA含量从(0.249±0.021)增加到(0.427±0.019)，增加了(71.48±0.026)%(P<0.01，见图1A)，电导率从(15.92±0.18)ms/cm增加到(16.3±0.11)ms/cm，增加了(2.39±0.102)%(P<0.05，见图1B)。该结果表明，大黄素能破坏MRSA菌体细胞膜的结构，导致菌体内的无机离子和大分子的外流。

图1 大黄素对MRSA41577大分子(A)和电导率(B)的影响(n=3)Fig.1 Effect of EM on macromolecules and conductivity against MRSA41577(n=3)

2.3 大黄素对MRSA41577可溶性蛋白的影响 蛋白分析软件测定结果表明，8 μg/mL的大黄素作用供试菌株16 h后，菌体内可溶性蛋白的含量从160.51 ng降低到107.86 ng，降低了32.8%(P<0.01)，见图2、图3。表明大黄素能够明显抑制菌体可溶性蛋白的合成。

图2 SDS-PAGE检测大黄素对MRSA41577蛋白合成的影响Fig.2 Effect of EM on the soluble protein against MRSA41577 by SDS-PAGE

图3 大黄素对MRSA41577蛋白含量的影响Fig.3 Effect of EM on the content of MRSA41577 protein

2.4 大黄素对MRSA41577核酸含量的影响 DAPI染色结果显示，大黄素能够降低菌体内DNA和RNA的含量，与对照组相比，8 μg/mL的大黄素作用菌体16 h后，DNA含量从(125.89±2.36)下降到(119.825±1.14)，降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)。RNA含量从(30.268±0.624)下降到(28.248±0.31)，降低了(6.67±0.36)%(P<0.05)。见图4。

图4 大黄素对MRSA41577核酸含量的影响(n=3)Fig.4 Effect of EM on the synthesis of nucleic acid against MRSA41577(n=3)

2.5 大黄素与DNA的作用方式 紫外吸收光谱结果显示，10 μg/mL大黄素与不同浓度的PBR322(终浓度分别为0、0.3、0.5、0.7 μg/mL)作用30 min，随着DNA浓度的增加，大黄素的紫外吸收值逐渐增加，出现了明显的增色效应，表明大黄素与DNA结合方式为氢键结合。见图5。

图5 大黄素对DNA吸收光谱的影响1～4：分别为0、0.3、0.5、0.7 μg/mL的pBR322Fig.5 Effect of EM on the absorption spectrometric titrations with DNADifferent concentrations (1～4：0、0.3、0.5、0.7 μg/mL) of PBR322

3 讨论

MRSA是医院感染的主要病原菌之一[8-9]，目前，临床上使用的抗MRSA药物仍然存在很大的局限性，因此获得能抑制MRSA的药物是解决临床细菌感染的有效方法之一。Cao等[10]研究表明，虎杖根状茎乙醚萃取物能够显著抑制MRSA的生长，而大黄素是虎杖根状茎的主要成分，因此本文对大黄素抑制MRSA41577的作用及其机制进行了研究。TTC研究结果显示，大黄素对MRSA41577具有显著的抑制作用，其最小抑菌浓度为8 μg/mL。

细胞膜是保证细胞内环境稳定和细胞正常的代谢的屏障结构，细胞膜的破坏，会影响菌体的生命活动[11]。本实验室前期研究结果表明，大黄素对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，其抑菌作用机制主要是通过改变细胞膜的通透性，抑制菌体内的蛋白质合成，抑制代谢关键酶的活性[12]。为探究大黄素对MRSA 41577细胞膜的影响，测定了经大黄素作用后培养液中大分子和电导率的变化，研究结果显示，8 μg/mL的大黄素作用菌体6 h后，电导率和大分子与对照组相比分别增加了(71.48±0.026)%和(2.39±0.102)%。说明大黄素可破坏MRSA的细胞膜的结构，导致菌体内无机离子和大分子外流，影响菌体正常的生理活动。蛋白质是细胞的物质基础，是生命活动得以有效进行的重要保证，蛋白质合成受阻，会严重影响细胞的生理机能。本研究结果显示，大黄素能显著抑制MRSA41577的蛋白合成，其中8 μg/mL的大黄素作用菌体16 h后，与对照组相比，蛋白总量下降了32.8%。蛋白质的合成往往受核酸的调控，为进一步探究大黄素对MRSA 41577核酸合成的影响，本研究测定了大黄素对MRSA核酸合成的影响，DAPI染色结果显示，大黄素能抑制MRSA核酸的合成，其中8 μg/mL的大黄素作用菌体16 h后，DNA和RNA含量分别降低了(4.82±1.06)%和(6.67±0.36)%。核苷酸是核酸发生改变的最低突变单位，组成核苷酸的磷酸基团和碱基是药物分子识别的关键位点[13]。一般情况下，药物与DNA的相互作用方式比较复杂，包括静电作用，氢键结合，范德华力，离子键和疏水作用等，且这几种作用可以同时存在并相互诱导和强化[14]。其中，化合物的紫外吸收光谱峰如果出现了红移现象和减色效应，表明该化合物与DNA发生了嵌入结合，反之则表明该化合物与DNA发生的是静电作用或沟槽作用。如果化合物的紫外吸收峰出现增色效应，表明化合物与DNA发生的是氢键结合[15-17]。本研究的紫外吸收光谱结果显示，随着质粒DNA浓度的增加，大黄素的紫外吸收值逐渐增加，出现了增色效应。说明大黄素能通过和DNA之间发生氢键结合，影响DNA进行正常的复制和转录，降低核酸的含量。

综上所述，大黄素对MRSA的抑制作用机制主要是通过破坏细胞膜的完整性，与DNA发生氢键结合，干扰核酸的复制和转录，进而影响蛋白质的合成，致使菌体丧失其生物学功能。

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(编校：吴茜，谭玲)

Antibacterial mechanism of emodin on methicillin staphyloccocusn aureus

BI Yue, SUI Jia-qi, QIAO Rui-hong, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate effect of emodin on cell membrane, protein and nucleic acid synthesis of MRSA41577, and systematically investigate the anti-bacterial mechanism of emodin.MethodsTTC assay was used to detected the anti-bacterial activity of emodin on MRSA 41577.Conductivity and macromolecular were detected to investigate the effect of emodin on MRSA41577 cell membrane .SDS-PAGE was used to detect the effect of emodin on the soluble protein synthesis.DAPI staining was used to detect the effect of emodin on nucleic acid synthesis.UV-visible spectrophotometric was used to detected the interaction between emodin and DNA.ResultsEmodin has significant inhibitory activity on MRSA41577, and the minimum inhibitory concentration was 8 μg/mL.After treated with 8 μg/mL emodin for 6h, compared with control group, the macromolecular and conductivity improved (71.48±0.026)% (P<0.01) and (2.39±0.102)%(P<0.05), sepreatly.Compared with control, after treated with 8 μg/ml emodin for 16h，the protein reduced 32.8%, and the contents of DNA and RNA reduced (4.82 ±1.06)%(P<0.05,) and (6.67±0.36)%(P<0.053).The UV-visible spectrophotometric results indicated that emodin could integrate with DNA through hydrogen bond.ConclusionThe anti-bacterial mechanism of emodin mainly through damage the cell membrane, inhibit the replication and transcription of DNA through hydrogen bond, inhibit the synthesis of protein, and thus inhibit the biological function of bacteria.

emodin; MRSA; anti-bacterial; mechanism

辽宁省教育厅科学研究一般项目(No.L2013412);大连市科技计划项目(No.2013E13SF108)

毕月，女，学士在读，研究方向：生物科学，E-mail：1027510122@qq.com；谢明杰，通讯作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com

R285.5

A

1005-1678(2015)08-0027-04