抗栓小肽RWR的毒理学试验研究

郑海锋，赵海霞，王少华，杨涛，杨利军

(山西医科大学 生物化学与分子生物学学科 省部共建细胞生理学教育部重点实验室，山西 太原 030001)



抗栓小肽RWR的毒理学试验研究

郑海锋，赵海霞，王少华，杨涛，杨利军Δ

(山西医科大学 生物化学与分子生物学学科 省部共建细胞生理学教育部重点实验室，山西 太原 030001)

目的 对具有自主知识产权的抗栓小肽RWR进行毒理学研究和安全性评价。方法 分别对RWR进行小鼠急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核形成试验、小鼠精子畸形试验和大鼠30d喂养试验。结果 急性毒性试验动物经腹腔注射MTD大于120 mg/kg；骨髓细胞微核试验、精子畸形试验结果均为阴性；大鼠30 d喂养试验对大鼠体质量、食物利用率、脏器系数、血生化等各项指标均未见不良影响。病理组织学观察肺、肝、脾、肾、心脏均未见明显与注射样品有关的组织学病理改变。结论 在本试验条件下，RWR对动物的生长发育、造血功能、肝肾功能、器官组织均无明显毒性作用。

RWR；毒理学；安全性

心脑血管疾病是严重危害人类健康的常见病，特别是心肌梗死、脑梗塞等血栓性疾病危害更大。纤维蛋白原α链中的RGD(Arg-Gly-Asp)序列与血小板表面整合素αIIbβ3(GPⅡb/Ⅲa)特异性结合是血栓形成的最终途径[1-3]。阻断此过程即可阻断各种病理性的血栓形成。含有RGD序列的多肽可以竞争性抑制纤维蛋白与血小板结合，从而抑制血栓形成[4-6]。本课题组根据含RGD序列多肽的抗栓特性及血栓性疾病研究现状，在RGD序列的基础上，设计合成了一种新型小肽RWR(Arg-Gly-Asp-Trp-Arg)[7]。初步药效学研究表明RWR通过与血小板表面整合素αIIbβ3受体结合，抑制血小板聚集从而起到抗栓作用，其分子量小，免疫原性低，抗血小板活性强[8]。为探讨RWR作为抗血栓药物的可行性，给临床用药提供合理、可靠的科学依据，本文旨在对RWR进行毒理学安全性研究。

1 材料与方法

1.1 药物 小肽RWR由上海强耀生物科技有限公司合成(纯度≧95.10%)；环磷酰胺(cyclophosphamide，monohydrate)购自Sigma公司。

1.2 仪器 Beckman AU5800生化仪2；KDC-2046低速冷冻离心机；美国Thermo冷冻切片机；日本Olympus IX51光学显微镜。

1.3 实验动物 试验用昆明小鼠、SD大鼠均从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.4 实验方法

1.4.1 急性毒性试验:昆明小鼠50只，雌、雄各半，体质量18～22 g，随机分为5组。①阴性对照组：生理盐水组；②RWR 24 mg/kg组；③RWR 48 mg/kg组；④RWR 96 mg/kg组；⑤RWR 120 mg/kg组。给药组每组用生理盐水配置相应的RWR溶液，浓度分别为0.12%、0.24%、0.48%、0.6%，2次腹腔注射给药，间隔3 h，每次腹腔注射0.2 mL/10 g，对照组注射相应体积的生理盐水，所用小鼠注射体积范围为0.36～0.44 mL。连续观察14 d动物反应情况，记录动物外观、活动状态，大、小便性状及颜色、被毛、呼吸、鼻、眼、口腔分泌物及死亡情况。

1.4.2 小鼠骨髓细胞微核形成试验：昆明小鼠50只，雌、雄各半，体质量25～30 g，随机分为5组。①阳性对照组：环磷酞胺(40 mg/kg)；②阴性对照组：生理盐水组；③RWR 24 mg/kg组；④RWR 96 mg/kg组；⑤RWR 120 mg/kg组。给药组每组用生理盐水配置相应的RWR溶液，浓度分别为0.12%、0.48%、0.6%，2次腹腔注射给药，间隔24 h，每次腹腔注射0.15 mL/10 g，所用小鼠注射体积范围为0.37～0.45 mL。第2次给相同剂量受试药物后6 h颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓细胞制片。观察骨髓多染性红细胞微核并计算微核发生率，以千分数(‰)表示。

1.4.3 小鼠精子畸形试验：昆明小鼠25只，体质量25～30 g。分组同小鼠骨髓细胞微核生成率实验，给药组每组用生理盐水配置相应的RWR溶液，浓度分别为0.12%、0.48%、0.6%，每天腹腔注射1次，每次注射0.15 mL/10 g，所用小鼠注射体积范围为0.37～0.45 mL。连续5 d。于首次给药后第35天处死小鼠，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检。每只小鼠计数5000个结构完整的精子，计算精子畸变率(以百分率计)。

1.4.4 30d喂养试验：SD大鼠80只，雌、雄各半，体质量70～75 g，随机分为4组。①阴性对照组：生理盐水组；②RWR 4.5 mg/kg组；③RWR 18.8 mg/kg组；④RWR 75.0 mg/kg组(分别为有效剂量的6倍、25倍和100倍)，每组用生理盐水配置相应的RWR溶液，浓度分别为0.09%、0.376%、1.5%，连续给药30 d，每次注射0.5 mL/100g，所用大鼠注射体积范围为0.35～1.5 mL。给药前及给药期间每周记录1次大鼠体质量和进食量，给药结束后空腹过夜，眼眶采血检测血液生化学指标，称取体质量及其肝、肾、脾、卵巢(睾丸)的重量，计算脏体比，并取肝、脾、肾、心脏、肺组织作HE染色，观察其组织形态学变化。

2 结果

2.1 急性毒性试验 在14 d的观察过程中，RWR按照24、48、96、120 mg/kg注射给药，阴性对照组注射相应体积的生理盐水，观察小鼠无一死亡，无明显的中毒症状，无不良反应，外观健康，行为活泼，被毛光滑、体质量、呼吸及大小便正常，鼻、眼和口腔未发现异常分泌物。可以认为RWR药物的小鼠经腹腔1天最大耐受量大于120 mg/kg(高出前期药效学有效剂量的100多倍)，则可认为该药物在给药有效剂量条件下安全性较好。

2.2 RWR对小鼠骨髓微核形成的影响 随着RWR浓度的增大，骨髓多染红细胞微核形成率差异无统计学意义，各剂量组与阴性对照组比较差异无统计学意义，阳性对照组与阴性对照组比较，骨髓多染红细胞微核形成率显著性增大(P<0.01)。见表1。

表1 RWR对小鼠骨髓细胞微核形成试验Tab.1 The assay of RWR on MN formation of PCE

*P<0.01，与各性别下阴性对照组比较，compared with negative control group in each gender

2.3 RWR对小鼠精子畸变率的影响 随着RWR浓度的增大，各剂量组精子畸变率差异无统计学意义，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，均差异无统计学意义，阳性对照组与阴性对照组比较，精子畸变率有显著增大(P<0.01)。见表2。

表2 RWR对小鼠精子畸形试验Tab.2 The assay of RWR on mice sperm aberration rate

*P<0.01，与阴性对照组比较，compared with negative control group

2.4 30 d喂养试验

2.4.1 RWR对大鼠体质量、食物利用率的影响 在30 d喂养试验过程，各组动物状况良好，未发现有中毒症状，亦无动物死亡。随着RWR浓度增大，大鼠每周平均体质量、每周食物利用率和总的食物利用率差异无统计学意义，且各给药组与生理盐水组间差异无统计学意义。见表3、表4。

表3 RWR对SD大鼠体质量的影响Tab.

表4 RWR对大鼠食物利用率和体质量增重的影响Tab.4 Effect of RWR on rat food utilization rate and the increase of body weight

2.4.2 RWR对血液各生化指标的影响：在大鼠30 d喂养试验中，随着RWR浓度的增大，各剂量组间相比较，各生化指标均差异无统计学意义，且各剂量组与对照组相比较，各生化指标均差异无统计学意义，且均在生理正常范围内。见表5。

表5 RWR静脉注射给药30 d对大鼠血液生化学指标的影响Tab.5 Effect of RWR on rats blood biochemical indexes among 30 day intravenous RWR

2.4.3 RWR对大鼠脏体比的影响：随着RWR浓度的增大，各剂量组间的脏器系数均无明显差异；且各剂量组与对照组比较，脏器系数差异均无统计学意义。见表6。

表6 RWR静脉注射给药30 d对大鼠脏器系数的影响Tab.6 Effect of RWR on the organ coefficient of rats among 30 day intravenous RWR

2.4.4 RWR对各脏器组织结构的影响，组织病理学观察：RWR注射30 d后，各脏器外形、色泽、位置、大小未见明显异常；取各组大鼠肝、脾、肾、心脏、肺组织，做HE染色。结果均未见明显异常。见图1、图2。

图1 雌性大鼠脏器HE染色组织形态学(HE，×400)Fig.1 HE stained with tissue morphology of organs in the female rat(HE, ×400)

图2 雄性大鼠脏器HE染色组织形态学(HE，×400)Fig.2 HE stained with tissue morphology of organs in the male rat (HE,×400)

3 讨论

RGD序列为人纤维连接蛋白与其受体的结合点，能与αIIbβ3受体特异性结合[9，10]。血栓形成时，纤维蛋白α链的两个RGD肽序可被活化的血小板αIIbβ3受体特异性识别[11-12]，在相邻的血小板之间形成横桥，而一个血小板又可与多个纤维蛋白原结合，使血小板通过整合素αIIbβ3受体与纤维蛋白原“桥联”黏聚成团，促使血小板聚集，介导纤维蛋白与血小板的结合，该过程犹如链条，把相邻的血小板连在一起，形成血栓[13-14]。含RGD序列的小肽或药物也可与纤维蛋白原的RGD序列竞争性结合活化的血小板膜整合素αIIbβ3 受体，从而抑制整合素αIIbβ3介导的生物学效应从而抑制血栓形成。因此含RGD序列的多肽衍生物作为抗栓剂受到广泛重视。

RGD小肽仅能与血栓部位活化的血小板整合素αIIbβ3受体特异性结合，而对循环血小板无影响，这正是RGD小肽发挥血栓靶向性作用的基础[15]，另外整合素αIIbβ3在休眠的内皮细胞和其他正常组织中低表达甚至不表达[16]，因此RGD小肽主要药效以外的作用更弱，即对药效学以外的组织器官毒性更低，为治疗血栓性疾病提供了一种新的途径，而且其独特的抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用具有其它抗血栓药物无法比拟的优点，使得治疗血栓性疾病靶向性用药有了更好的发展前景。如果能证实其毒副作用很小，符合多肽类药物的毒理学标准，将为进一步进入临床研究奠定基础。本研究即是在其基础上进行的毒理学研究和评价。

RWR急性毒性实验LD50>120 mg/kg，小鼠骨髓细胞微核生成率实验、小鼠精子畸变率试验、30 d喂养试验均为阴性结果，可说明RWR小肽毒性很低。这是由于本实验所用药品RWR与纤维蛋白原相比，其分子量仅为689.7，而纤维蛋白原的分子量为45000，小分子量的RWR受到空间干扰的因素更小，可以更加有效的阻断纤维蛋白原与整合素αIIbβ3受体的相互作用，并且由于其分子量相对小，代谢产物组成种类相对少，这也可以有效减少其药效以外的毒性作用。

考虑到RWR的药用有效剂量，在本实验条件下，并未测出其LD50值，这与肽类物质本身稳定性相对较低、易于受到生物体代谢酶的降解有关外，还与含RGD序列的肽类衍生物的靶向性有关，特别是课题组在RGD序列的基础上引入疏水性极强的疏水氨基酸W，同时引入R，使其与受体的结合力更强，作用效果更好[7，17]，进而使其用药相对有效剂量降低、在生物体内单位体积分布下降，这个也是其毒性相对较低的一个因素。本试验条件下，RWR符合药品安全性毒理学评价标准对药品的要求，作为药用，RWR有进一步开发利用价值。

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(编校：谭玲)

Toxicological assessment of antithrombotic small peptide RWR

ZHENG Hai-feng, ZHAO Hai-xia, WANG Shao-hua, YANG Tao, YANG Li-junΔ

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Cellular Physiology of Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo evaluate the toxicological safety of antithrombotic small peptide RWR with independent intellectual property right.MethodsToxicity test in mice, mice bone marrow micronucleus assay, mice sperm abnormality test, and 30-day feeding test in rats were carried out in this study.ResultsThe MTD of acute toxicity test for rats was larger than 120 mg/kg.The results of bone marrow micronucleus assay, mice sperm abnormality test were all negative.Thirty-day feeding test had no adverse effects on body weight, food utility rate, organ coefficient, blood routine index of rats.There was also no histological changes related to RWR in lung, liver, spleen, kidney and heart of rats.ConclusionRWR had no obvious toxicity on animal growth, hematopoietic function, kidney function and organ tissue and so on.

RWR; toxicology; safety

国家科技部重大新药创制计划(2012ZX09103301-010)；山西省自然科学基金(2012011041-5)；国家自然科学基金青年基金(81101895)；山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划[晋教科(2012)10号]

郑海锋，男，硕士，研究方向：含RGD小肽的设计合成及功能研究，E-mail：zhenhaifeng215@foxmail.com；杨利军，通讯作者，男，博士，副教授，研究方向：系列蛋白多肽药物的设计合成和生物学活性研究，E-mail：yanglijunmm@126.com。

R996.3

A

1005-1678(2015)08-0006-05