普鲁兰糖无色素高产菌株的选育研究进展

于林艳，张金华，刘飞，王淼，朱希强,Δ

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012；2.山东省药学科学院，山东 济南 250101)



普鲁兰糖无色素高产菌株的选育研究进展

于林艳1，2，张金华2，刘飞2，王淼1，朱希强1,2Δ

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012；2.山东省药学科学院，山东 济南 250101)

普鲁兰糖(pullulan)是由出芽短梗霉菌(AureobasidiumPullulans)发酵产生的一种线性高分子聚合物，是通过麦芽三糖以α-1,6糖苷键连接而成。普鲁兰多糖因其良好的安全性、稳定性、低粘性，在医药、食品等多个领域具有广泛的用途。目前，制约普鲁兰糖工业化生产的最主要问题是多糖产量低以及出芽短梗霉发酵过程中分泌的黑色素难以完全去除。本文以此为出发点，对近年来普鲁兰糖无色素高产菌株选育的进展情况进行整理和分析，从而找出更高效的菌株选育方法，为普鲁兰糖无色素高产菌株的进一步选育奠定基础。

普鲁兰糖；出芽短梗霉；无色素；高产菌株；研究进展

普鲁兰糖(pullulan)，又名茁酶多糖，是出芽短梗霉在发酵过程中产生的一种粘性胞外多糖，它是一种分子量高达250kDa左右的线性聚合物，作为商业化的产品，现在已经在各国上市。普鲁兰糖的化学结构是以α-1,6糖苷键连接的聚麦芽三糖，即葡萄糖按α-1,4糖苷键连接成麦芽三糖，麦芽三糖单元再以α-1,6糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成的线性高分子多糖，结构见图1。普鲁兰糖为无定形多糖，分子量一般在5.0×104～5.0×106之间[1]，聚合度为100～5000，分子量取决于聚合度，而聚合度由菌株类型、培养时间、碳源种类等因素影响。因此，可以通过改变这些因素来调整分子量的大小[2]可以用来适应不同的用途，也可以使用普鲁兰酶对高分子量普鲁兰糖进行降解，以得到不同分子量规格的多糖产品。

图1 普鲁兰糖结构Fig.1 The structure of pullulan

普鲁兰糖独特的连接方式赋予了普鲁兰糖独特的粘合性、成纤维性、成型性、强阻气性等性质，其溶液易溶于水，产生胶凝作用，溶液粘稠稳定，普鲁兰多糖富含有羟基，因此水溶液呈中性，不溶于醇和油类，耐酸、耐碱、耐PH值，性质十分稳定，故其被广泛的应用于食品、化工、医药和环境等方面，特别是在健康和制药方面有很高的应用价值。2006年，普鲁兰糖作为新增食品添加剂(国家卫生部2006年8号公告)，这极大促进了普鲁兰糖的工业化生产和应用的相关研究[3]。

普鲁兰糖的产生菌是出芽短梗霉菌，生产菌种的质量是决定普鲁兰糖生产和应用的关键因素。出芽短梗霉在发酵产普鲁兰多糖的同时会产生黑色素，该色素能够牢固地粘附在普鲁兰糖上，增大了普鲁兰糖的纯化工艺的复杂度的同时还造成多糖得损失。另外，由于出芽短梗霉菌株本身的产糖能力普遍不高，这就提高了普鲁兰糖的生产成本[4]。

类似于其他微生物的菌种选育，高产普鲁兰糖菌株的选育研究，早期主要集中在一些传统的育种方法上。随着出芽短梗霉菌分子生物学相关研究的逐步深入，普鲁兰糖的生物合成基因簇现已被成功克隆，因而明确了其中多数基因的功能[5]。普鲁兰糖生物合成的分子生物学基础研究，能够帮助人们了解普鲁兰糖的生物合成机制，这有利于人们打破传统的育种方法，故可利用基因工程手段定向的改良工业生产菌株。基于此，本文主要阐述普鲁兰糖高产菌株选育的研究进展情况[6-8]。

1 普鲁兰糖高产菌株选育[9]

为了获得普鲁兰糖无色素的高产菌株，国内外研究人员在微生物菌种改造方面做了大量的工作，主要集中于诱变育种、基因组改组育种以及基因工程育种，下面分别对其研究进展进行概述。

1.1 诱变育种 诱变育种，是用物理的、化学的因素诱导微生物，使其目的基因发生改变，进而获得新性状菌株的改良方法。基本的诱变育种方法主要有物理诱变、化学诱变和复合诱变3类，分别对这3种方法所诱导的突变类型的特点进行概述。

1.1.1 物理诱变育种:物理诱变因其操作安全、流程简单，见效快，是微生物育种的一个重要途径。当今发酵工业中的生产菌种绝大部分都是通过物理诱变选育出来的，因而在发酵工业中，物理诱变具有不可替代的位置。目前，研究人员最常用的物理诱变是紫外线诱变。

前苏联科学家Imeshenstskii[10]利用紫外线照射野生型菌株，经紫外线处理的菌株与原始菌株相比，普鲁兰糖产量提高了2.7倍；英国学者Tarabasz-Szymanska[11]对紫外诱变出芽短梗霉，得到一株无色素多糖的变异株，对该变异菌株进行第二次紫外诱变，得到一株优良的高产普鲁兰糖的变异菌株，在试验条件下，3 g/L的普鲁兰糖的产量提高到10 g/L，经优化后产量达到70 g/L；波兰人Gniewosz[2]，对出芽短梗霉菌进行紫外诱变，获得了一株产白色素的突变菌株，普鲁兰糖产量为28 g/L；王大伟等[12]，通过对出芽短梗霉As3.2756进行四轮紫外诱变，获得了一株高产普鲁兰的变异株PB518，使糖的转化率达55%以上，经过多次传代表明菌株稳定;方宣钧等[13]，对出芽短梗霉菌进行紫外诱变，得到了一株普鲁兰糖产量比出发菌株提高51%的菌株，并且产色素水平较低；滕利荣和孟庆繁等[14]，采用紫外诱变得到一株高产普鲁兰糖菌株T1,使普鲁兰糖的底物转化率达30.14%，是出发菌株的5.7倍；相茂功[15]，利用紫外诱变，筛选到一株不产色素的突变菌株；容誉[16],对出芽短梗霉原生质体进行紫外诱变，得到了两个突变体，其多糖转化率是原始菌株3倍，并且发酵周期缩短了7 h；靳建衷[17]，对野生菌株A.pullulans NG进行3轮紫外诱变，成功获得一株白化突变株UVMU3-1，该突变菌株的多糖产量是出发菌株的1.6倍，单位菌体产糖量是出发菌株的1.65倍，糖转化率是出发菌株的1.59倍；高璇璇等[18]，通过紫外诱变进行育种，获得了一株高产普鲁兰多糖且色素水平较低的突变菌株A22，其多糖产量比出发菌株提高了31%，且遗传性稳定。

传统的物理诱变能够提高菌种产生多糖的能力，但是新的、更有效的育种方法仍然吸引着研究人员进行不断的探索。与紫外诱变相比较，离子注入诱变具有诱变谱较广、操作较简单、正突变率较高、菌种多次诱变产生的饱和性和抗性较少、工业微生物的发酵水平提高等优点。徐志平[19]，第一次将离子束注入诱变应用到出芽短梗霉，在初筛中得到了一株多糖产量有所提高的菌株，再将经紫外-亚硝酸复合诱变的菌株作为原始菌株，对其进行两次离子束注入诱变，成功获得到五株产量明显提高的菌株，其中两个菌株比原始菌株的多糖产量分别提高30%多和近40%，取得了显著的效果。

1.1.2 化学诱变有种:化学诱变育种，主要是指利用一些化学物质，对目的微生物处理使其性状发生改变。与物理诱变剂相比较，化学诱变剂主要通过取代DNA分子中氢原子，使碱基改变而诱发基因突变，进而产生对微生物的诱变作用，化学诱变比物理诱变更具有专一性是因为它们只是对基因的某些特定部位发生作用而对其余部位无影响[20]。

有文献报道[21]，浓度0.2到1.0 mol/L的亚硝基胍对出芽短梗霉菌株具有诱变作用，影响葡聚糖的产量。细胞能够存活的诱变剂剂量为0.02%到8.9%，此时菌种的形态变异率很高，并且有利于产生多聚糖。有研究人员报道[22]诱导高产量的葡聚糖的最佳变异条件是：亚硝基胍浓度为0.5%，照射时间为3 h，细胞存活率大约在1.0%。将适宜浓度的秋水仙素添加到基础培养基中也可以提高出芽短梗霉的变异频率。Catley等[23]利用化学诱变剂(溴乙烷)处理出芽短梗霉菌株，从得到的一系列菌株中发现了这样一种现象，即出芽短梗霉处于酵母状细胞型时最有利于普鲁兰糖的生成；前苏联科学家Imeshenstskii[10]对野生型菌株用0.3%的秋水仙素处理，突变菌株产普鲁兰糖的量增加了7～8 mg/L；1993年West[24]，利用化学诱变剂进行诱变，目的是想获得不产色素或是色素产量相对较低的菌株。

多数的化学诱变剂，虽然产生点突变的比例高以及DNA畸变的比例低，但是不可否认的是，很多化学诱变剂都具有潜在的致癌性，它们的使用不仅对环境造成污染，还会对工作人员自身造成毒害。

1.1.3 复合诱变育种:单一的物理诱变育种或化学诱变育种，只能在一定程度上得到相对较好的结果。与之相比，复合诱变育种具有协同效应的优势，即同时合理的使用两种两种以上方法，对微生物细胞的诱变效果较好。金其荣等，利用紫外和烷化剂对出芽短梗霉菌株进行复合诱变，筛选得到的诱变菌株的多糖产率高达60～70 g/L，多糖转化率高达60%～70%，并且黑色素分泌较少；于航等[25]利用紫外线、DES复合诱变，获得一株低色素出芽短梗霉变异菌株G-58，发酵液颜色白色，吸光度为0.300，多糖产量19.2 g/L以上，发酵性能稳定；张雯等[26]，采用先用紫外光照诱变两次，再用亚硝酸和硫酸二乙酯(DES)处理一次的方法，对出发菌株AS3.0933进行复合诱变，得到的突变菌株普鲁兰糖为20.2 g/L，是原始菌株的2.77倍；贺红星[22]，对原始菌株GS01进行2轮紫外诱变和亚硝酸诱变，经过2轮筛选，变异菌株GS228的多糖产量有了2倍的提高，并且无色素分泌或色素淡化，突变菌株GS228的菌落大小以及质地和颜色都显著优于原始菌株GS01；朱永强等[27-28]，以一株经60Co诱变后不产色素的普鲁兰菌株作为原始菌株，采用紫外诱变和亚硝酸诱变，得到的变异菌株多糖产量达35.8 g/L,葡萄萄糖转化率达64%；王兴华等[29]，对实验室出发菌株出芽短梗霉AP8进行甲基磺酸乙酯(EMS)和紫外线(UV)复合诱变处理，获得的变异菌株UV60多糖产量为22.1 g/L，色素含量低且遗传稳定；余小六[30]，采用紫外线和γ-射线对出芽短梗霉菌A.pullulans ATCC201253进行复合诱变，得到一株不产色素菌株A.pullulans CCTCC M2012259，多糖产量为26.03 g/L。

1.2 基因组改组 基因组改组技术[31-38]，是在原生质体融合技术基础上发展起来的。美国Maxygen公司的Stemmer等于2002年，提出了全基因组改组技术，作为新的体内分子育种方法，该技术以分子进化技术为核心，在全基因组水平上实现快速定向进化，短时间内就可以获得正突变菌株。该技术使现代育种和进化工程的内容得到了丰富，使工业微生物的应用取得巨大的经济效益。它将单个基因延伸到整个基因组，因此，可以在更为广泛的范围水平内对菌种的目的性状进行优化组合。

基因组改组技术，是将诱变和原生质体融合育种相结合，将原始菌株经人工诱变后形成突变库，继而将突变库中的那些正向突变菌株制备成原生质体，按照等比例混合后即进行多亲本原生质体融合，这些突变随机融合后将在全基因组进行交换重组，最后从中筛选出性状得到优化的重组体，由此构成重组体库，至此完成一轮基因组改组。若一轮基因组改组后，性状还不够理想，就可将重组体库中的正向变异菌株再制备成原生质体，进行多次递归式原生质体融合，直到筛选出多重正向进化标记的目标菌株。

基因组改组最大的优点是，即使在不清楚菌株的基因型和表型的相关机制时，通过多轮循环的基因组改组，也可以将某一理想性状的多个甚至十几个突变基因迅速的组合在一起而达到菌种改良的目的。基因组改组技术凭借其固有的优势，使其在提出后的短短几年时间内，就在菌种改良方面取得了显著的成果，得到了生物工业界的广泛关注。

陈习娟[39]第一次将此技术应用于出芽短梗霉菌，第一，研究原生质体生成率最高的条件：出芽短梗霉菌培养至16 h后在含0.1%甘氨酸的培养基预处理30 min，,蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶的使用浓度为2 mg/mL，酶解在30 ℃下进行1.5 h,将原生质体用KCl溶液进行重悬；第二，对原生质体进行灭活标记采用紫外灭活和热灭活的方法,最佳时间都为25 min,灭活率分别高达到99.98%和100%；第三，研究了原生质体的最优融合条件:在25%的浓度、融合时间是7 min、融合温度是30 ℃、分子量为6000且有二甲亚砜、Ca2+等辅助试剂存在的条件下,原生质体的融合率相对较高,达到0.71‰；第四,筛选重组子，经过三轮基因组改组后，筛选得到2株高产突变菌株A312和A38,其中A312菌株在发酵培养基中经70 h发酵后,普鲁兰糖产量为20.3 g/L,比出发菌株DES7和C75提高了2倍多，且A312、A38在传代3次后，普鲁兰糖产量与传代前相比仅分别有0.79%和0.5%变化率，说明A312和A38菌株的遗传特性比较稳定；冯印[40]，对原始菌株CICC 140334进行2轮紫外线和3轮亚硝基胍复合诱变,获得6株突变株,原始菌株多糖产量是22.10 g/L，六株突变株多糖产量是24.12 g/L、26.39 g/L、30.23 g/L、32.45 g/L、35.43 g/L、37.84 g/L；将6株突变菌株作为基因组改组选育高产普鲁兰多糖的出发菌株，经过原生质体的制备、原生质体的灭活、原生质体融合后，涂布于20%高糖平板进行初筛和摇瓶发酵进行复筛,经过6次传代培养后,获得的优良菌株F41、F42高产多糖且性状较稳定，多糖产量分别达44.83 g/L、45.18 g/L,比出发菌株分别提高了102.85%、104.43%；张晶等[41]，对出芽短梗霉菌进行紫外线和亚硝基胍复合诱变，得到普鲁兰糖高产菌株P1、P2和色素分泌相对较少的菌株P3、P4，将其作为出发菌株，经过5轮基因组改组，摇瓶发酵复筛选出2株多糖产量较高、色素分泌能力较低的突变菌株F51、F52，其中突变菌株的多糖产量分别为42.38 g/L、42.60 g/L,与出发菌株P1相比，多糖产量提高了41.27%、42.00%，突变株发酵液OD值是0.378、0.363，与出发菌株P3相比，降低了17.30%、20.57%。

1.3 基因工程育种 传统的诱变育种方法虽然可以筛选出目的菌株，但局限是，不仅诱变的方向难以控制而且诱变的性质难以掌握。诱变引起的DNA链上的突变位置是随机的，因此进行需要大量的筛选才有机会获得目的菌株。

随着现代分子生物学技术的发展，限制酶和DNA连接酶在20世纪70年代的发现以及基因敲除技术在20世纪80年代的逐渐成熟，使得基因工程技术得以建立。该技术克服了传统菌种改良技术的随机性和盲目性，有着针对性强，操作简单和效果显著的优势，使微生物的遗传育种技术不再局限于诱变育种、基因组改组育种，革命性地推动了工业微生物菌种改良的发展。利用基因工程技术，不仅可以在基因水平上对微生物自身的靶基因进行精确修饰；还可以通过分离供体生物中的基因，将该基因导入受体菌种，进而使外源目的基因在受体菌种进行正常的复制和表达。

构建表达载体和基因打靶(Gene targeting)是基因工程技术改良菌种分为两个阶段。第一代基因工程育种，即构建表达载体阶，首先利用限制性内切酶酶切靶基因的DNA分子和载体DNA，获得外源性基因片段和具相应切口的载体DNA，然后利用DNA连接酶连接外源基因DNA片段和用于表达的载体DNA片段，即重组表达载体构建完成。将其转入宿主菌，含有外源目的基因的重组载体能够进行自我复制和表达，合成目的产物-即人类需要的物质。第二代基因工程育种，即基因打靶阶段，该技术利用同源DNA分子重组的原理，使靶细胞染色体上的同源序列与外源性DNA分子进行重组，将外源性DNA片段定点整合到靶细胞基因组的预定位点上，或者是与靶基因组上的某一DNA片段置换，实现对菌种染色体DNA的精确修饰及改造，且经过修饰和改造的基因能够随染色体DNA的复制而稳定的复制，而改变靶细胞的遗传特性，完成有目标的菌种改良。

目前，有研究人员已成功克隆出普鲁兰糖合成酶基因。2010年，Kang等[42]已经成功敲出了普鲁兰糖合成酶基因，使普鲁兰糖不再合成；2012年，Ma等[43]同样利用同源重组的方法对原始菌株HN6.2的普鲁兰糖合成酶基因进行敲除，筛选得到了敲除菌株DPS1，与原始菌株相比，该菌株普鲁兰多糖产量下降。以上试验说明，普鲁兰糖合成酶基因在普鲁兰糖合成过程中起着关键作用。因此，增加普鲁兰糖合成酶基因在出芽短梗霉基因组内拷贝数或者通过重组载体增强普鲁兰糖合成酶基因表达可能有助于提高普鲁兰糖产量。

2 展望

从我国实际情况出发，在当今和今后相当长的一段时间内，普鲁兰糖仍是食品及医药行业重要的原料。目前，国内普鲁兰糖在基础与应用的研究方面比较滞后。对于普鲁兰多糖工业化产量的提高，国内的大研究大多只是集中于发酵条件的优化以及诱变育种及基因组改组育种，因此，通过基因工程育种选育普鲁兰糖无色素高产菌株是十分必要的。随着分子生物学技术的开发和应用，充分利用现有的分子生物学手段和基因工程技术，将会开创高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌菌种的新局面。

[1] 郭法利,欧杰,马晨晨,等.出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生物合成普鲁兰多糖的研究进展[J].广东农业科学，2013，43(13)：113-115.

[2] Gniewosz M, Duszkiewicz-Reinhard W.Comparative studies on pullulan synthesis, melanin synthesis and morphology of white mutant Aureobasidium pullulans B-1 and parent strain A.p.-3[J].Carbohydrate Polymers, 2008，72(3)：431-438.

[3] Cheng KC,Demirci A, Catchmark JM.Pullulan: biosynthesis, production, and applications[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 92(1)：29-44.

[4] Wang D, Yu X,Gongyuan W.Pullulan production and physiological characteristics of Aureobasidium pullulans under acid stress[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(18): 8069-8077.

[5] Chan GF, Bamadhaj HM,Gan HM,Rashid Noor Aini A.Genome sequence of Aureobasidium pullulans AY4, an emerging opportunistic fungal pathogen with diverse biotechnological potential[J].Eukaryot Cell, 2012, 11(11): 1419-1420.

[6] 付桂明,许杨,李燕萍.工业微生物菌种改良与重组工程技术[J].食品科学，2006，12(27)：924-929.

[7] 孟甜,李玉锋.现代工业微生物育种技术研究进展[J].生命科学仪器，2009，7(12)：3-6.

[8] 张彭湃.微生物菌种选育技术的发展与研究进展[J].生物学教学，2005，30(9)：3-5.

[9] 汪杏莉,李宗伟,陈林海,等.工业微生物物理诱变育种技术的新进展[J].生物技术通报，2007，(2)：114-118.

[10] Imshenetskii AA, Kondrat’eva TF.Hexokinase and sucrose phosphorylase activity of cell-free preparations of haploid and diploid strains of Pullularia pullulans[J].Mikrobiologiya, 1980, 49(1) : 98-101.[11] Tarabasz Szymańska L,Galas E.Two-step mutagenesis of Pullularia pullulans leading to clones producing pure pullulan with high yield[J].Enzyme Microb Tech, 1993, 15(4): 317-320.

[12] 王大伟,明炬,吴慧敏,等.高产普鲁兰菌株的筛选和发酵条件探索[J].吉林大学自然科学学报，1995，11(4)：97-101.

[13] 方宣钧,张英.出芽短梗霉菌株紫外诱变及其发酵条件优化[J].农业生物技术学报，1998，6(2)：23-29.

[14] 滕利荣,孟庆繁,谢力,等.普鲁兰产生菌的紫外诱变及其发酵条件[J].吉林大学学报(理学版)，2003，4(2)：209-212.

[15] 相茂功.高产普鲁兰菌株的诱变筛选及发酵条件优化[D].济南：山东大学.2009.

[16] 容誉.通过短梗霉原生质体诱变筛选普鲁兰高产菌[D].武汉：华中科技大学.2008.

[17] 靳建忠.普鲁兰糖高产菌株选育及培养基优化[D].沈阳：沈阳农业大学.2011.

[18] 高璇璇,汪建明,卢星达,等.高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉的诱变育种[J].中国食品添加剂，2013，S1：45-49.

[19] 徐志平.复合诱变出芽短梗霉选育普鲁兰高产菌株[D].武汉：湖北大学.2012.

[20] 马再超.产铁载体海洋普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)HN6.2菌株遗传改良的研究[D].青岛：中国海洋大学.2012.

[21] Bermejo JM,Dominguez JB,Goi FM,et al.Influence of pH on the transition from yeast-like cells to chlamydospores in Aureobasidium pullulans[J].Antonie van Leeuwenhoek, 1981, 47(5): 385-392.

[22] 贺红星.高产低色素普鲁兰生产菌株的复合筛选和发酵条件研究[D].甘肃：甘肃农业大学.2008.

[23] Catley BJ, Whelan WJ.Observations on the structure of pullulan[J].Archives of Biochemistry and Biophysics, 1971, 143(1): 138-142.

[24] West TP,Reed Hamer B.Polysaccharide production by a reduced pigmentation mutant of the fungus Aureobasidium pullulans[J].FEMS Microbiology Letters, 1993(113): 345-349.

[25] 于航.低色素出芽短梗霉的选育及其培养条件优化[D].无锡：江南大学.2007.

[26] 张雯,张盛贵.复合诱变选育出芽短梗霉高产菌株[J].中国酿造，2008(9)：47-50.

[27] 朱永强.短梗霉多糖菌的诱变筛选和发酵工艺[D].武汉：湖北工业大学.2010.

[28] 朱永强,方尚玲,覃敬羽, 等.短梗霉多糖菌的复合诱变筛选及培养基优化[J].食品与发酵科技，2010，46(1)：47-50.

[29] 王兴华,韩丛琴.复合诱变选育短梗霉多糖高产菌株[J].食品科学，2012，33(17)：188-192.

[30] 余小六.普鲁兰生物合成及其高产策略研究[D].苏州：苏州大学.2013.

[31] 陈涛,陈洵,王靖宇,等.DNA及基因组改组在代谢工程中的应用[J].化工学报，2004，55(11)，1753-1758.

[32] 代兴华,蔡爱华,张厚瑞,等.基因组改组技术及其在工业微生物改良中的应用[J].食品与发酵工业，2001，37(7)：142-147.

[33] 代云见,王明蓉,杜天飞.微生物基因工程育种技术的研究进展[J].国外医药(抗生素分册)，2008，29(5)：193-196，200.

[34] 杜云平,周庆丰,余国莲,等.Genome shuffling技术在微生物育种中的应用[J].现代农业科学，2008(11)：24-27.

[35] 芦志龙,吴冰,袁尔东,等.基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展[J].生物技术通报，2008，S1：135-140，148.

[36] 罗剑,杨民,施巧琴.微生物菌种选育中的基因组改组技术及其应用进展[J].生物技术，2008(1)：81-83.

[37] 罗情情,王明兹,陈必链,等.基因组改组技术及其在微生物中的应用[J].农产品加工(学刊)，2014，02(02)：62-65+68.

[38] 徐敏.应用基因组改组选育[D].无锡：江南大学.2008.

[39] 陈习娟.应用基因组改组技术选育普鲁兰高产菌[D].武汉：华中科技大学.2009.

[40] 冯印.基因组改组构建高产茁霉多糖菌株研究[D].吉林：吉林农业大学.2011.

[41] 张晶,王丹,张静,等.基因组改组选育低色素高产茁霉多糖生产菌株[J].食品科技，2012，37(7)：16-21.

[42] Kang BK, Yang HJ, Choi NS,et al.Production of pure beta-glucan by Aureobasidium pullulans after pullulan synthetase gene disruption[J].Biotechnol Lett,2010, 32(1): 137-42.

[43] Ma ZC,Z Chi, Q Geng, et al.Disruption of the pullulan synthetase gene in siderophore-producing Aureobasidium pullulans enhances siderophore production and simplifies siderophore extraction[J].Process Biochemistry,2012, 47(12): 1807-1812.

(编校：谭玲)

Rsearch progress on breeding of pullulan high-yield strain without melanin

YU Lin-yan1,2, ZHANG Jin-hua2, LIU Fei2, WANG Miao1, ZHU Xi-qiang1,2Δ

(1. Pharmaceutical College, Shandong University, Ji’nan 250012, China; 2. Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Ji’nan 250101, China)

Pullulan is a linear glucosic polysaccharide produced by the polymorphic fungusAureobasidiumPullulans, which has long been applied for various applications in medical and food industry due to its security, stability and low adhesive ability.At present, the two problems in restricting pullulan industrial production are the low polysaccharide production and melanin secreted which is hard to erase completely, giving the following process some problem.As a starting point, this review article collects and analyzes the progress on the breeding of pullulan high-yield strain without melanin in recent years, in order to find more efficient strains breeding methods, laying a foundation for further breeding of pullulan high-yield strain without melanin.

pullulan;AureobasidiumPullulans; no melanin; high-yield strain; research progress

于林艳，女，硕士，研究方向：生化药学及发酵工程，E-mail:yulinyan@126.com;朱希强，通讯作者，男，博士，研究员，硕士生导师，研究方向：生化药学及发酵工程，E-mail:artical13256745998@126.com。

Q813

A

1005-1678(2015)06-0181-04