乳链菌肽生物合成及高产菌株选育的研究进展

倪志坚，王绍花，刘飞，朱希强,Δ

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012；2.山东省药学科学院 博士后工作站，山东 济南 250101)



乳链菌肽生物合成及高产菌株选育的研究进展

倪志坚1，王绍花2，刘飞2，朱希强1,2Δ

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012；2.山东省药学科学院 博士后工作站，山东 济南 250101)

乳链菌肽(Nisin)是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)的某些亚种在生长过程中产生的一种天然活性多肽类细菌素。由于其具有优越的抑菌活性，现已作为一种高效、无毒的绿色食品添加剂广泛应用于食品工业。然而目前Nisin主要通过乳酸菌发酵生产，其工业化产率较低，尚不能满足庞大的市场需求，因此合理构建高产Nisin菌株意义重大。本文主要综述了以Nisin生物合成关键基因的功能表达及其调控机制为主线的分子成熟途径，并对Nisin高产菌株的研究状况作了概述，为实践进一步高产菌株的研究提供了方向，对Nisin的工业化放大生产具有一定指导意义。

乳链菌肽；生物合成；关键基因；调控；高产菌株

乳链菌肽，又称乳酸链球菌素，属于羊毛硫抗生素(lantibiotics)家族。成熟的活性Nisin单体分子由34个氨基酸组成，其典型特征是分子结构中含有多种稀有氨基酸，这些非编码氨基酸的存在不仅侧面反映了Nisin形成过程的特殊性，而且与Nisin稳定性及其生物功能密切相关[1]。一般情况下，Nisin对大多数革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖具有强烈的抑制作用，而且在人体消化道内蛋白酶作用下能够被迅速降解而不影响肠道内正常菌落结构，现已成为一种公认的安全天然生物食品添加剂，并在全球范围广泛应用于食品行业，同时在生物医药和轻工业等领域也极具广阔的应用前景[2]。

1 Nisin生物合成的关键基因分析

1988年，Buchman等[3]首次克隆出编码Nisin的基因并开始对其合成机理进行了深入研究。现已基本确定Nisin生物合成的基因由一段控制其合成、成熟、调控及免疫的nisABTCIPRKFEG基因簇所构成，约14kb，位于染色体的1个约70kb的接合型转座子上。这11个基因的表达各不相同，且功能复杂，但活性Nisin的产生需要该基因簇中所有基因的共同作用[4]。

1.1 Nisin的结构基因 nisA是Nisin前体的结构基因，负责编码Nisin前体肽。该肽分子由57个氨基酸构成，包括N-端23个氨基酸组成的前导序列和C-端34个氨基酸组成的成熟Nisin分子的前身(见图1A)。Nisin前体的前导肽可以被修饰和转运蛋白所识别，即Nisin前体分子必须在其前导肽的引导下经历翻译后修饰和加工过程，才能形成成熟活性Nisin分子[4]。1993年Kuipers等[4]通过构建一个缺失4bp的结构基因(△nisA)，研究了Nisin在nisA缺失和完整存在下的表达情况，结果nisA缺失菌株没有生成Nisin的任何结构，这表明了nisA的表达依赖于其自身结构的完整性。但向培养基中加入少量活性Nisin后，nisA的转录又能开始；随后又通过构建nisA启动子与报道基因gusA的融合子，并转入适当受体，结果得到了gusA基因的表达产物，且表达水平与加入Nisin的量直接相关，从而证实了nisA启动子的可诱导性，并提示了Nisin合成系统潜在的复杂调控机制。此外，Sailaja等[5]报道指出nisA启动子还可以被外加半乳糖诱导启动，进一步研究表明该诱导机制是通过一个结合在转录起始点-107bp处TCT重复序列上的转录调节因子所介导的，且这个转录调节因子与Nisin介导的诱导机制也有关联。

图1 Nisin结构变化图A：Nisin前体；B：完全修饰的Nisin前体；C：成熟Nisin★：可被修饰的氨基酸；黑色箭头：N-端氨基酸的加工；白色箭头：前导肽的切割位点Fig.1 Schematic changes of Nisin structureA：Nisin precursor；B：fully modified Nisin precursor；C：mature Nisin★：residues that will be modified；Black arrow：processing of the N-terminal residue；white arrow：the processing site of the leader peptide

1.2 Nisin的成熟基因

1.2.1 nisBC基因:nisBC是Nisin前体的修饰基因。其中nisB编码1个脱水酶蛋白(NisB)，由993个氨基酸组成。NisB具有两性跨膜的α-螺旋结构，该区域可以和细胞膜结合，使NisB定位于细胞膜上，从而发挥其特定功能：将Nisin前体分子中的丝氨酸脱水形成脱氢丙氨酸，同时将苏氨酸脱水形成β-甲基脱氢丙氨酸。Ra等[6]实验表明，nisB基因的缺失会直接造成Nisin产物的消失及菌株免疫力的急剧降低。

nisC编码一个含414个氨基酸的环化酶蛋白(NisC)，它主要参与Nisin前体分子中脱水氨基酸残基与半胱氨酸形成硫醚桥的过程。NisC也定位于细胞膜上，它对Nisin前体的翻译后修饰作用至关重要，敲除nisC基因后，经NisB脱水处理后的Nisin前体就不能形成硫醚桥，导致Nisin抑菌活性完全丧失。Li等[7]对nisC基因进行体内过表达并纯化后发现NisC在水中能以单体形式存在，光谱分析显示该蛋白含有锌元素，这种异源产生的NisC蛋白在体外也能使已脱水的Nisin前体肽成环，并且产物切掉前导肽后具有完全成熟的Nisin活性。而锌元素的存在，可能与NisC的环化功能密切相关，这一点在后来Okeley的研究[8]中已经得到证实。

1.2.2 nisT基因:nisT位于nisB的下游，编码1个含600个氨基酸的转运蛋白(NisT)，负责完全修饰的Nisin前体的跨膜运输。NisT与ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白家族有强烈的同源性，是耗能运输蛋白，含2个结构域：其C-端含有ATP结合的特征结构序列，可以结合ATP；N-端的α-螺旋形成跨膜结构域，能使NisT镶嵌在细胞膜上。Siegers等[9]发现NisB对NisT的跨膜转运功能有辅助作用，进一步研究显示NisB、NisC和NisT之间不仅有相互作用，而且在细胞质膜内侧形成了一个膜相关的酶复合体(NisBC2T2)，包含1分子的NisB，2分子的NisC和2分子的NisT，从而保证了Nisin前体的翻译后修饰及分泌工作的高效性。nisT敲除实验显示[6]培养基中检测不到Nisin活性，细胞不能将经过修饰的Nisin前体分泌到胞外，同时菌体的生长受到了很大抑制，从而证明了nisT在Nisin转运过程中的关键程度。然而，Fang等[10]研究表示，在没有生物膜结构和nisT基因或NisT存在的体外Nisin合成系统中，同样可以形成完全修饰的Nisin分子，这表明不同的合成体系中，NisT对Nisin成熟过程的关键程度不同，且NisT的功能发挥具有一定独立性。

1.2.3 nisP基因:nisP编码1个枯草杆菌蛋白酶样的胞外丝氨酸蛋白酶(NisP)[11]，含682个氨基酸残基，负责完全修饰的Nisin前体上前导序列的切割，形成成熟活性Nisin分子(见图1C)。该蛋白酶肽链N-端是由220个残基构成的pre-pro序列，包括1个分泌性信号肽区，负责将NisP分泌到细胞外，和1个信号肽酶切割位点，在NisP成熟过程中信号肽会被切掉；其C-端是1段含110个氨基酸的保守序列，它是细胞表面的膜锚着点，这表明NisP锚定在细胞外膜上；中间残基部分就是该酶的功能催化区。叶嗣颖等[12]成功构建了一个nisP缺失的突变株，此菌株能分泌完整的Nisin前体肽，却不能分泌成熟的活性Nisin分子。利用Nisin产生菌的菌体胞膜蛋白处理该Nisin前体后，才能形成有活性的成熟Nisin分子，从而证实了nisP基因在Nisin生物合成最后成熟阶段的决定性作用。

1.3 Nisin的表达调控基因 Nisin的生物合成由双组分调控系统nisRK基因表达调控[4]，位于nisP基因下游。其中nisR编码1个含228个氨基酸的应答调节蛋白(NisR)，是Nisin生物合成中的转录激活因子。该蛋白发生磷酸化后能结合到nisA和nisF的启动子区，诱导其下游相关基因的转录。nisK编码1个含446个氨基酸的组氨酸感应激酶(NisK)，锚定于胞外膜上，能与成熟Nisin分子发生结合。当胞外环境中出现成熟Nisin、Nisin突变体或Nisin类似物时，它会结合到NisK上并激发下游信号转导[4]。研究显示[13]nisR或nisK的敲除都能够使nisA转录缺陷，导致L.lactis菌株不能正常表达Nisin，体现了nisRK在Nisin生物合成中的重要作用。然而nisRK操纵子自身的表达是独立于Nisin调控的，由组成型启动子nisR启动表达。据报道[14]，虽然nisR启动子强度相对较大，但其起始密码子是GTG，且nisK上缺乏高效的核糖体结合位点，导致nisRK转录效率较低，因此一般野生型Nisin产生菌中nisRK的表达水平都不高。汪蕊等[15]通过构建重组质粒pMG76e-nisRK，替换了原启动结构，并转入宿主菌后，获得的重组菌株使Nisin的产量明显提高，这为高产Nisin工程菌的构建了可靠依据。

1.4 Nisin的免疫抗性基因 Nisin作为一种天然生物防腐剂，对大多数革兰氏阳性细菌均有抑制作用。一般认为[16]它能与细菌细胞膜上LipidII分子结合形成Nisin-LipidII孔洞复合物，在纳摩尔级浓度下便使细胞膜穿孔，造成细胞内小分子内容物的流失，同时LipidII分子也是细菌细胞壁生物合成的重要中间体，因此Nisin对LipidII分子的“劫持”会干扰细胞壁的正常合成，从而导致细胞的死亡。而在Nisin产生菌中，这种抑菌效应显然能被菌株自身所免疫，这主要是Nisin生物合成基因簇上的4个基因共同决定的，即nisI和nisFEG。它们能编码相应的免疫物质，防止产物Nisin对细胞自身的毒害作用。其中nisFEG基因分别编码3个疏水性蛋白[17]：NisF(225个氨基酸，24.7 kDa)、NisE(247个氨基酸，28.2 kDa)和NisG(214个氨基酸，24.2 kDa)。其中NisE、NisF与ABC转运蛋白家族有很强的同源性，且NisF是胞质ATP结合蛋白，而NisG含有3～4个跨膜结构域，能定位于胞膜上。这3个蛋白可组成一个类ABC的转运蛋白复合体nisFEG，该复合体能够把入侵细胞膜的Nisin转运到细胞外部环境，防止由于Nisin浓度过高而形成孔洞，因此在免疫机制中发挥着重要的作用。nisF、nisE和nisG中任一基因的缺失都会导致细胞Nisin产量的下降以及细胞对Nisin敏感性的提高。

nisI基因位于nisC下游，编码1个含245个氨基酸的NisI前体蛋白分子[18]，其N-端存在1段高保守信号序列，是胞质膜的膜锚着点，在转运过程中会发生修饰并切除，从而形成NisI的2种存在形态：分泌到胞外的游离形态和膜结合形态。这2种形态的NisI都能直接与Nisin发生特异性结合作用，因此NisI可以作为Nisin的“拦截”分子，阻止其与细胞膜上lipidII分子结合而造成穿膜的孔洞，从而使细胞自身免受Nisin的侵害作用，形成了自我免疫的第一道防线。同样，nisI基因缺失研究表明细胞仍能产生活性Nisin，但其产量和对Nisin的敏感水平均有显著变化。最近有报道指出[19]，可能还存在其他细胞成分也参与了菌体的Nisin免疫抗性。Froseth等[20]鉴定到了1个Nisin抗性基因(nsr)，能编码一个膜结合蛋白(NSR)，其C-端存在一段保守的末端特异性蛋白酶结构域。该蛋白介导的Nisin抗性就是通过破坏Nisin分子的第28位甲基羊毛硫氨酸和第29位丝氨酸之间结构，导致Nisin分子降解而增强菌体自身免疫。它是L.lactis中首个被鉴定并阐明的直接由蛋白酶降解Nisin而形成的Nisin免疫抗性机制。

2 Nisin的生物合成途径概述

成熟活性Nisin的产生需要该生物合成基因簇上所有基因的共同作用，而这11个基因序列分别由nisA、nisR、及nisF启动子控制其转录。其中nisR启动子是组成型表达的，而nisA和nisF启动子由nisRK所形成的双组分调控系统调控表达。Nisin具体合成途径如下[4](见图2)：①首先胞外信号(如活性Nisin)与细胞膜上的NisK结合，使NisK迅速发生自我磷酸化并将磷酸基团转移给NisR；②磷酸化的NisR作为转录激活因子，结合到nisA和nisF启动子上，激活转录，并启动下游基因表达，从而在核糖体上合成Nisin前体肽和相应的一系列蛋白(NisB、NisC、NisT、NisP及脂蛋白NisI和转运蛋白复合体NisFEG)；③Nisin前体分子经NisB的脱水作用及NisC的环化作用，形成5个分子内硫醚桥，完成Nisin前体的翻译后修饰的过程；④NisT水解胞质内ATP提供能量，将经过翻译后修饰的Nisin前体跨膜转运至胞外；⑤锚定于胞膜上的NisP对完全修饰的Nisin前体进行胞外加工，切去前导肽序列，释放出有活性的成熟Nisin分子，完成Nisin整个生物合成的最后一步。而脂蛋白NisI和转运蛋白复合体NisFEG虽未直接参与Nisin合成过程，但它们与菌体自身对Nisin的免疫性密切相关，一直负责保护着生产菌自身免受胞外Nisin的伤害，从而为菌体的一切生命活动提供了安全保障。

图2 Nisin生物合成路径模型P*：磷酸基团；P：诱导型启动子；P：组成型启动子Fig.2 The model of Nisin biosynthesis pathwayP*：phosphate group；P：inducible promoter；P：constitutive promoter

3 Nisin高产菌株的研究进展

Nisin作为一种安全环保型天然抗菌素，具有非常广阔的市场价值和经济效益。随着商品市场的发展，Nisin的市场需求日益扩大，而Nisin主要是通过乳酸菌发酵方法生产，且一般天然菌种的性能差、生产能力较低，因此构建稳定高产Nisin菌株以满足实际需求日益迫切。

3.1 传统诱变育种 诱变育种指利用某些理化诱变剂处理微生物细胞，使其发生突变，再通过某些特定的方法筛选出具有目标特性的突变菌株。常用诱变剂主要有物理诱变剂，如紫外线、X射线、宇宙射线、微波、高能电子流等、化学诱变剂如烷化剂、羟化剂等；还有生物诱变剂，包括能够引起DNA突变的病毒。长期以来，人们在利用诱变育种提高Nisin产量方面已经进行了大量研究，并取得了一些成效。早在1973年，Kalra等[21]就尝试利用紫外线照射的方式对Streptococcuslactis-6菌株进行诱变，结果Nisin的效价较原始菌株提高了2倍；姜丽艳等[22]采用硫酸二乙酯(DES)对L.lactis ATCC11454进行诱变处理，筛选到了一株遗传特性稳定的Nisin抗性菌株，其效价最高达到2570IU/mL，比原始菌株提高了2.13倍；申斐等[23]采用微波对Nisin产生菌进行诱变处理以提高Nisin产量，获得一突变菌株，但没有达到预期诱变效果；还连栋等[24]利用紫外线、LiCl、60Co及8-MOP+NUV等多种理化诱变剂对原始菌株进行多次单因子和复合诱变处理，获得一Nisin高产突变株，其效价能稳定在2300～2500 IU/mL；随后，陈洪卫等[25]利用低能氮离子注入联合紫外线照射的方法进行原始菌株的诱变处理，也获得一高产突变菌株，其Nisin效价达到2291.75 IU/mL；李海娜等[26]采用紫外线、微波和亚硝酸钠对出发菌株进行复合诱变处理，并结合Nisin抗性筛选机制选育出一遗传性状稳定的高产菌株Nis123，其Nisin产量高达5250 U/mL，比出发菌株提高了4.3倍。由此可以看出，传统诱变育种方法选择范围比较广泛，在选育Nisin高产菌株方面具有一定的实效性。

3.2 Genome shuffling技术育种 Genome shuffling技术又称基因组重组技术，是20世纪末提出的一种将传统诱变与原生质体融合的新兴菌种改良技术，其原理是首先通过传统诱变筛选获得若干正向突变菌株，然后以这些突变菌株作为递推式原生质体融合的出发菌株库，经过多次原生质体融合后，株内基因组间发生随机重组，最终通过适当的筛选方法获得具备目标性状的改良菌株。1996年，Stoyanova等[27]将2个同源的低产Nisin产生菌L.lactis729和L.lactis1605进行原生质体融合，筛选出融合子的Nisin产量比融合前提高了10～14倍；张旭等[28]采用超声波和DES对原菌株先后进行单因素和复合诱变处理，获得的突变株S-1、D-1、F-1作为出发菌株，经过2轮原生质体融合后，成功选育出一Nisin高产菌株，其Nisin产量较原始菌株提高了69.8%；Zhang等[29]对原始菌株进行紫外诱变和DES两轮化学诱变处理后，利用genome shuffling技术对初步获得Nisin突变菌株再进行研究，最终收获菌株的Nisin产量大约是原始菌株的2.43倍，同时其耐受性也得到很大的提升。实践表明，genome shuffling技术在选育高产Nisin菌株方面成效显著，这为进一步应用该技术选育优良菌种提供了参考。

3.3 基因工程方法育种 近年来，随着分子生物学理论与技术的日益成熟，以及对Nisin的生物合成途径和代谢调节认识的深入，在利用基因工程技术对Nisin产生菌进行遗传改造而获得高产菌株方面也取得一定进展。目前主要通过对Nisin生物合成的相关基因进行过表达或增加其拷贝数来提高Nisin合成能力。1998年Kim等[30]将Nisin生物合成相关的调控和免疫基因nisRK、nisFEG融合在同一载体pND300上，再导入受体菌中进行过表达，结果获得的工程菌Nisin产量比原产生菌提高了20%左右，且其生长速度也明显加快；2005年Cheigh等[31]试图通过构建表达载体pOri23-nisZ、pOri23-nisRK、pOri23-nisFEG，并转入Nisin生产菌中以此获得nisZ、nisRK和nisFEG过表达的工程菌，结果nisRK和nisFEG过表达菌株的Nisin产量均提高了约50%，但菌体的生长速度受到一定影响，而nisZ过表达菌株的预期效果不明显；2014年Kong等[32]构建了nisA的单独多拷贝载体和nisin合成基因簇的过表达载体共转化的工程菌，能使Nisin产量提高3.4倍，但菌体生长明显受限。后又将nisA片段与Nisin合成基因簇整合到同一表达载体上，同时优化了nisA启动子和发酵条件，最终得到工程菌的nisin产量达到原始菌株的6倍多。

国内对于Nisin基因工程方面的研究起步较晚，1995年中国科学院微生物研究所率先完成了对乳链菌肽的基础研究，并将选育出的Nisin高产菌株投入生产，实现了2500 L发酵罐的放大实验及中试产品的应用试验[33]；樊苗苗等[34]通过构建nisA游离型和nisA整合型表达载体以实现nisA的过表达，结果游离型表达载体菌株的NisinA产量提高了31%，而整合型菌株的NisinA产量虽也有一定程度的提高，但其生物量明显降低；Hu等[35]通过增加Nisin产生菌中nisI基因的表达水平来研究Nisin产量变化，结果Nisin的产量最多提高了32%，而且工程菌对Nisin的抗性水平也显著提高；汪蕊等[36]通过构建表达载体pMG76e-nisRK、pMG76e-nisI-RK以及pmsp3535H4-nisI-nisR-nisK，合成重组菌，结果前两组重组菌株的Nisin产量均提高了45%左右，但后一组重组菌株Nisin产量增幅略低，反映了载体启动子表达效率的相对强弱对Nisin产率的直接影响。后来他们又构建了含表达载体pMG76e-nisZBTCI的工程菌，这使Nisin产量提高了约70%。通过RT-PCR检测分析了原菌株与重组菌株中Nisin合成基因簇中11个基因的表达情况，结果显示工程菌的大部分基因都不同程度地上调了，表达上调的基因对Nisin合成效率的提高具有关键意义。

4 展望

在全社会都在崇尚绿色安全食品的今天，天然防腐剂乳链菌肽日益受到人们的关注。面对多年来的理论研究与实践应用，Nisin作为一种天然食品添加剂的安全性和高效性已经无可置疑。同时，随着研究的深入，Nisin的应用目前已扩展到造纸、食品包装、畜牧业、生殖、医疗等领域，其优质性未来必定还会受到更多行业的亲睐。鉴于目前Nisin的工业化产量与实际应用之间的不协调状况，在选择合适的育种方法以获得优质高效的Nisin表达菌株方面，以上技术手段已为相关研究者提供了一些有益的参考，相信随着生化科技的进步和工业化生产的发展，实现Nisin规模化生产必将指日可待。

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(编校：王俨俨)

Research progress on Nisin biosynthesis and breeding of high-yield strains

NI Zhi-jian1, WANG Shao-hua2, LIU Fei2, ZHU Xi-qiang1,2Δ

(1. College of Pharmacy, Shandong University, Ji’nan 250012, China; 2. Postdoctoral Workstation, Pharmaceutical Academy of Sciences of Shandong Province, Ji’nan 250101, China)

Nisin, produced by several strains in the growth process ofLactococcuslactis, is a natural antimicrobial polypeptide.Now, Nisin has served as an effective and safe food additive extensively used in food industry in many countries and regions because of its excellent antimicrobial activity.However, the current production of Nisin is largely fermented by lactobacillus and its industrialized production still can not meet enormous market needs, therefore establishing reasonably high-yield Nisin strains is of great significance.This review mainly summarizes the development pathway of molecule based on the functional expression of Nisin biosynthetic genes and regulation of gene expression, and also the study status on high Nisin-producing strains which provides practical foundation for further study on expected strains as well as some useful guidance for large-scale industrialized production of Nisin.

Nisin; biosynthesis; key genes; regulation; high-yield strains

倪志坚，男，硕士在读，研究方向：生化技术药物及发酵工程，E-mail：mars_pharma@163.com；朱希强，通讯作者，男，博士，研究员，研究方向：生化技术药物，E-mail：xistrong@sina.com。

Q939.9

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1005-1678(2015)06-0171-06