多组分生化药注射剂HPLC特征图谱研究思路探讨

任丽萍，范慧红

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)



多组分生化药注射剂HPLC特征图谱研究思路探讨

任丽萍，范慧红Δ

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

本综述在系统总结近年来国内外有关指纹图谱研究文献和多组分生化药注射剂质控现状的基础上，结合实验室工作积累，探索性地提出了多组分生化药注射剂HPLC特征图谱的研究思路，以期进一步推动多组分生化药注射剂特征图谱相关研究工作的开展。

多组分生化药注射剂；指纹图谱；特征图谱；研究思路；质量控制

多组分生化药是一类原材料来源于人、动物的组织或者体液，或者通过发酵而来的非单一成分的药品。大多数该类产品的组成成分不完全明确，按照化学药品的质控方式很难控制其质量；并且动物来源、工艺条件的细小变化均有可能导致物质基础的变化，而这些质量上的变化较难通过终产品的质量标准加以控制，从而可能会引发不可预测的不良反应。

指纹图谱分析技术因其能够表征中药的整体特征性，引起了业内研究人员的广泛重视[1-2]。这一方法已被WHO、美国FDA和中国SFDA等认同并用于评价植物药或中药质量的批间稳定性[3-4]。

多组分生化药HPLC特征图谱建立的目的是通过对所得到的能够体现生化药整体特性的图谱识别，提供一种能够比较全面的控制生化药质量的方法，从化学物质基础的角度保证生化药注射剂的稳定和可靠。其具体方法是采用指纹图谱技术，将生化药内在物质特性转化为常规数据信息，用于生化药鉴别和质量评价。

1 多组分生化药注射剂质控现状

按国家食品药品监督管理局颁布的药品注册管理办法规定：天然生化药物有两大类：①天然物质中提取或通过发酵提取的有效单体及其制剂，此类生化药物要按照化学药品的注册办法审评；②由人、动物的组织或者体液提取的，或者通过发酵制备的具有生物活性的多组分制品，此类生化药物要按新生物制品注册办法审评。

多组分生化药的研究应该参照已颁布执行的《化学药品注射剂及多组分生化药注射剂基本技术标准(试行)》(国食药监注〔2008〕7号)进行。技术标准中明确指出：申报单位提供的研究资料应能证明各批次产品质量的均一、稳定；还指出：多组分生化药组成复杂，为保证产品质量的相对均一，应研究采用合适的分析方法控制产品的主要成份。例如对于多肽类药物，可采用指纹图谱的方法控制各多肽的种类及与主成分的相对含量。

多组分生化药注射剂的质量标准整体水平较低，除垂体后叶注射液曾收载于《中国药典》2005年版二部外[5]，其余品种均未收载于任何国内外药典中。目前上市的多组分生化药中，据不完全统计，仅在国家药品标准第九册和第十六册中收载的多组分生化药品种就有十六种之多，见表1。这类品种的质量标准还未完全统一，以脑蛋白水解物注射液为例，执行的质量标准就共有4个，分别属于新药转正标准、地标升国标标准等。参照多组分生化药新的注册管理办法要求，这类品种大多存在着标准不统一、有的同品种多个标准间尺度不统一，质量差异较大；标准中缺乏专属性较强的质控项目，无法保证产品质量的相对均一等问题。

表1 多组分生化药注射剂质量标准收载情况Tab.1 The quality specification of biochemical injection with multiple components

2 多组分生化药注射剂HPLC特征图谱研究的必要性

2.1 开展特征图谱研究，对多组分生化药工艺进行评价与研究 多组分生化药的组成、质量与原材料、提取工艺、制备工艺密切相关，仅靠成品的质量标准不能全面控制此类产品的质量，必须要结合起始原料和工艺过程的控制才能较有效地控制产品的质量，保证质量的一致性。因此起始原料的质量要求、工艺过程、原液(或原料药)的质量控制均属于质量控制的一部分。

由于多组分生化药组成的复杂性，仅靠质量标准中某一种或者某一类组分难以评价其提取工艺的优劣，进行特征图谱研究，不仅可以说明样品的组分、组成的一致性，阐述提取制备工艺的合理性；还可以对工艺稳定性进行研究，以保证不同批次产品质量的重现性；此外，由于多组分生化药注射剂多含有肽类、蛋白质、多糖等物质，这类物质在溶液或者高湿条件下降解或聚合的速度较干燥条件性更快。进行多组分生化药的特征图谱研究，可以详细了解外界条件如(pH值、温度、光照等)对生化药物稳定性的影响，选择适宜的辅料来提高制剂的物理化学稳定性和生物活性，从而对制剂处方工艺进行优化。

2.2 进行特征图谱研究，提高多组分生化药质量控制的专属性 多组分生化药物可能包含的组分种类较多，如氨基酸、微量元素、短肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、激素、生长因子、脂质、核酸及其降解产物等，鉴别项目应尽可能对所含组分进行特征性鉴别。特征图谱相似度鉴别是在多组分生化药注射剂的质量标准的基础上，为保证多组分生化药注射剂在安全、有效、可控的前提下，根据多组分生化药注射剂本身的特点新增加的一项专属性检验指标。

3 多组分生化药注射剂HPLC特征图谱研究现状分析

有2种多组分生化药注射剂——脑蛋白水解注射液和小牛血去蛋白提取物注射液其质量标准[6-7]的鉴别项目中规定了“供试品溶液的色谱图应与对照溶液的色谱图基本一致”，通过鉴别多肽等组分，对产品的一致性、均一性进行评价。但因为各家企业质量标准还未完全统一，不同标准中色谱分离条件不同，各企业所用的对照溶液也不一致，也缺乏量化的判定方法和标准，因此还不具有可操作性。

查阅相关文献和质量标准，近年来以国家评价性抽验工作公开发表的论文中[8-10]，一些多组分生化药如骨肽注射液、胸腺肽注射剂等在采用指纹图谱评价药品质量方面进行了探索性研究，但因为选取样品数量有限、不具有代表性未进行色谱分离条件的优化,大多未进行方法学验证研究,相似度评价参数的选择不同等原因，结果难以在实验室间甚至同一实验室内重现。因此，目前还未见相关产品质量标准中收载特征图谱相似度评价方法。

4 建立多组分生化药注射剂HPLC特征图谱方法研究思路

基于上述分析，在笔者所在实验室相关研究工作的基础上[11]，借鉴中药色谱指纹图谱研究的成果与经验，结合多组分生化药注射剂自身质量控制的特点，提出多组分生化药注射剂HPLC特征图谱的研究思路，见图1。

图1 多组分生化药注射剂HPLC特征图谱方法研究流程图Fig.1 The flow chart of HPLC specific chromatogram of biochemical injection with multiple components

多组分生化药特征图谱建立的内容包括：特征图谱分析方法的建立、特征图谱方法验证、数据处理和分析。多组分生化药特征图谱按照测试样品来源可以分为生化药的提取物、中间体以及注射剂。其中，提取物、中间体特征图谱主要是用于生产的内部控制、工艺评价以及质量相关性考察。

4.1 HPLC特征图谱分析方法的建立 多组分生化药特征图谱应满足专属性、重现性。其首要目的是能体现药品的整体特征，在满足表征化学成分群整体性质的前提下，要求有较好的重现性，应根据重现性要求选用合适的分析方法来获取特征图谱。特征图谱分析方法的可操作性系指针对不同用途，选用不同方法来达到不同的要求。

多组分生化药注射剂特征图谱的一般获取过程：

① 样品的选择和供试品溶液的制备：征集样品的首要前提是具有代表性，应是按照国家药监局批准的现行生产工艺生产的，最好提供提取液和制剂，必要时应提供中间体和辅料。供试品溶液制备的基本原则是保证其代表性和完整性，其好坏直接影响了整体分析结果的优劣及可信程度。

② 参照峰的选择：特征图谱的参照峰主要用于考察特征图谱的稳定程度和重现性，并有助于特征图谱的辨认。在多肽类的多组分生化药的HPLC特征图谱中，一般可从在紫外吸收波段有响应的色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸中筛选。参照峰一般因为峰面积较大，特征图谱相似度软件相似度算法是夹角余弦法，结果受大峰影响较大，因此，参照峰一般不选作共有峰。以小牛血去蛋白提取物为例，样品和对照品叠加图谱的典型图谱，见图2。最终选择色氨酸为参照峰。

图2 小牛血去蛋白提取物供试品和3种有紫外吸收的氨基酸对照品叠加图谱(a.色氨酸；b.苯丙氨酸；c. 酪氨酸；d小牛血去蛋白提取液)Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of deproteinized hemoderivative of calf blood solution and three kinds of amino acid reference standard with ultraviolet absorption(a. tryptophan; b. phenylalanine; c. tyrosine; d. deproteinized hemoderivative of calf blood solution)

③ 特征图谱获取：特征图谱试验条件应能满足特征图谱的需要，不宜简单套用含量测定用的试验条件，试验方法和试验条件选择应根据供试品的特点,设计合适的试验方案，通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的特征图谱。

以脑蛋白水解物注射液为例，其主要组分为低分子肽和游离氨基酸，因此在该品种的特征图谱研究中，首先征集了生产工艺基本一致、具有代表性的脑蛋白水解物溶液样品，设计梯度洗脱试验方案，以期对其特征性的多肽组分进行完全洗脱。脑蛋白水解物浓溶液不同企业样品的叠加图谱，见图3。

图3 不同企业脑蛋白水解物供试品特征图谱Fig.3 Specific chromatogram of cerebroprotein hydrolysate from different manufactures

以另一种多组分生化药小牛血去蛋白提取物注射液为例，其主要组分为氨基酸、低聚肽、核苷、无机离子等，其活性是多种成分综合作用的结果。因此在最终确定的特征鉴别方法中是梯度洗脱的方法，检测波长采用了214 nm，目的是能够反映该产品中的特征性组分。小牛血去蛋白提取物不同企业样品的叠加图，见图4。

4.2 HPLC特征图谱分析方法的验证 方法验证的目的是为了考察和证明采用的特征图谱测定方法具有可靠性和可重复性，符合特征图谱测定的要求。HPLC特征图谱实验方法验证所包括的项目有：专属性、精密度及耐用性等。方法验证的具体内容应从以下3方面考察：

4.2.1 专属性：多组分生化药的特征图谱一般认为分离峰越多越好，在大多数成分均能有响应的情况下，用典型的色谱图来证明其专属性。具体方法专属性可考虑采用峰纯度、总峰响应值等为考察参数。同时需要评价有关样品(提取物、中间体和成品)间的相关性，并尽可能显示出样品中特征响应，保证其有较大响应，从而减少方法的波动带来判别误差。

4.2.2 精密度：精密度是指规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测结果的接近程度。特征图谱实验方法的精密度通常以多次测量结果标准偏差来表达。具体精密度测量可用重复性和重现性进行考察，重复性和重现性的具体范围应据实际情况确定。

4.2.3 耐用性：特征图谱耐用性是指不同条件下分析同一样品所得测试结果的变化程度。对HPLC特征图谱，在实际验证中首先需要考虑实验环境、操作人员、实验仪器及色谱柱对实验结果的影响。特别需要考虑实验方法本身的参数波动的影响，如流速、柱温、流动相组成、分析溶液的稳定性等。

4.3 数据处理和分析 指纹图谱相似度分析目前在药品检验中应用较广的是国家药典会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统。采用相似度评价软件计算相似度时，若峰数较多，且最大峰面积超过总峰面积的60%，计算相似度时应考虑去除该色谱峰。对于用于鉴别的特征图谱，若能够提供对照提取物对照品，则优先考虑采用对照提取物作对照，也可以对照图谱作为对照。

5 多组分生化药注射剂HPLC特征图谱研究的展望

本文根据指纹图谱技术进展和多组分生化药质控现状，初步探索性地提出了多组分生化药注射剂特征图谱的研究思路，以期为该类药品的质量控制提供更多的方法与手段。指纹图谱技术虽已提出多年，目前在中药注射剂的质量控制中也有一定的应用，但涉及到在多组分生化药注射剂质量控制的应用也存在一些值得商榷的问题。在研究过程中，如何识别与药效相关的特征峰？如何选择色谱共有峰能最大程度的反映产品的内在质量？如何将多组分生化药特征图谱所获取的化学成分特征信息与生物活性相关信息进行关联？是否还能开发更适合多组分生化药注射剂特征图谱研究应用的软件？这些都是多组分生化药特征图谱研究的难点，还需要在以后的研究中进行更深入的研究。

[1] Cheng YY, Chen MJ, Tong WD.An approach to comparative analysis of chromatographic fingerprints for assuring the quality of botanical drugs [J].J Chem Inf Comput Sci,2003,43(3):1068-1076.

[2] Cheng YY, Chen MJ, Welsh WJ.Fractal fingerprinting of chromatographic profiles based on wavelet analysis and its application to characterize the quality grade of medicinal herbs [J].J Chem Inf Comput Sci,2003,43(6):1959-1965.

[3] WHO.General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine [M].Geneva：World Health Organization,2002.

[4] FDA.Guidance for industry botanical drug products[M].Center for Drug Evaluation and Research(CDER),2000.

[5] 中国药典2005年版二部[S].2005.

[6] 国家药典委员会.国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第九册[S].2003.

[7] 国家药典委员会.国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第十六册[S].2003.

[8] 王常禹，岳云飞，牛惠玲，等.骨肽注射液质量分析及研究[J].药物分析杂志，2010，30(11)：2197-2200.

[9] 梁蔚阳，邓锋，蒋玉辉，等.脑蛋白水解物注射液质量分析[J].药物分析杂志，2011，31(1)：190-194.

[10] 李勇，廖海明，梁成罡，等.胸腺肽注射剂反相HPLC特征图谱研究[J].药物分析杂志，2011，31(2)：288-292.

[11] 任丽萍，尼珍，范慧红.脑蛋白水解物及其注射剂的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2014，49(20)：1850-1853.

(编校：王冬梅)

Investigation of research method of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components

REN Li-ping， FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

The existing literature on fingerprint chromatography at home and abroad and the quality control of biochemical injection with multiple components were reviewed in this article. Combined with the laboratory research, It is proposed that the strategy for HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components in order to provide the basis for effectively promoting the establishment and development of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components.

biochemical injection with multiple components; fingerprint chromatography; specific chromatography; research method; quality control

中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金(2011A7)

任丽萍，女，硕士，副主任药师，研究方向：生化药品质量研究，E-mail：pplucky@126.com；范慧红，通讯作者，女，博士，研究员，研究方向：生化药品质量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

TQ460.72

A

1005-1678(2015)06-0161-04