肾上腺皮质激素对脊髓炎患者血清NMO-IgG抗体检测的影响

高文勇

(武汉市汉口医院 神经内科，湖北 武汉 430010)



肾上腺皮质激素对脊髓炎患者血清NMO-IgG抗体检测的影响

高文勇

(武汉市汉口医院 神经内科，湖北 武汉 430010)

目的 肾上腺皮质激素对视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)患者血清中NMO-IgG抗体检测研究影响。方法 收集武汉市汉口医院中临床诊断为视神经脊髓炎的患者30例，按随机数字表法分为肾上腺皮质激素组和对照组，每组15例。肾上腺皮质激素组患者在常规治疗的基础上给予肾上腺皮质激素治疗，对照组患者给予常规治疗。底物为稳定表达人源水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)的人胚肾293(human embryonic kidney 293，HEK293)细胞株，患者血清NMO-IgG水平的检测采用间接免疫荧光法。结果 30例视神经脊髓炎患者血清NMO-IgG阳性19例(63.3%)，血清抗体滴度为1:115～1:6355。肾上腺皮质激素组视神经脊髓炎患者血清NMO-IgG阳性率(86.7%)高于对照组患者(40.0%)(χ2=7.03，P<0.05)。结论 肾上腺皮质激素有助于NMO-IgG抗体的检测，可以提高临床诊断率。

肾上腺皮质激素；脊髓炎；NMO-IgG；水通道蛋白-4

肾上腺皮质激素简称皮质激素，其包括糖皮质激素以及盐皮质激素，糖皮质激素类药物有较强的抗炎作用。肾上腺皮质激素对感染性、化学性、物理性、免疫性或无菌性反应等原因引起的炎症，包括炎症病理发展过程的不同阶段有着显著的非特异性抑制作用。糖皮质激素通过对炎症抑制蛋白及某些靶酶的影响和对细胞因子及黏附分子的影响来实现抗炎症作用。糖皮质激素能够通过与细胞膜的非特异作用发挥抗炎作用，其在炎症疾病中有广泛的应用。糖皮质激素的主要作用是对炎症反应的抑制，当有较高的糖皮质激素浓度时，其能通过嵌入细胞膜从而对膜相关蛋白的理化性质以及活性进行改变，如对钙-ATP酶和钠-钾-ATP酶的改变[1]，导致异常的离子跨膜转运，对免疫细胞的功能以及减轻炎症反应有抑制作用[2]、使血液中的乳酸浓度降低[3]。

视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica，NMO)又称为Devic综合症，是对脊髓和视神经选择性侵犯的疾病，其能对脊髓和视神经选择性地累积，复发率高，Devic综合症为特发性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其病因病机尚不清楚。视神经脊髓炎为一种严重的单相病程疾病，近年来研究显示，NMO患者血清中有特异性的视神经脊髓炎-免疫球蛋白G(neuromyelitisoptica-immunoglobulin G，NMO-IgG)存在，即水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)抗体[4-5]。水通道蛋白-4抗体能够对疾病预后进行预测，以及作为反映疾病活动和评价药物疗效的指标[6-7]。NMO-IgG的发现不但为NMO的诊断提供了支持标准，也为进一步了解NMO提供了有效途径。本文探讨肾上腺皮质激素对脊髓炎患者血清NMO-IgG抗体检测的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年8月～2014年2月武汉市汉口医院符合NMO诊断标准[8]的30例NMO患者作为研究对象，其中男性12例，女性18例；发病年龄11～70岁，平均发病年龄为(31.2±11.3)岁；病程0.3～34年，平均(14.5±8.0)年；发病次数为2～17次，平均(10.6±3.5)次。排除对象：存在肝肾功能严重损害的患者；存在严重精神病，无法自主用语言交流的患者；在实验前1周内服用过类似激素类药物的患者。所有患者按随机数字表法分为肾上腺皮质激素组和对照组，每组15例。2组患者在年龄、性别、病史、病程以及工作等方面差异无统计学意义。本研究经过伦理委员会批准并获得患者知情同意。

1.2 材料 人胚肾293(HEK293)细胞株(购自上海研谨生物科技有限公司)，总RNA、质粒pEGFP-N1(购自军事科学院)，甲泼尼龙片(批号H20100730，购自Pfizer Italia s.r.l)，吐温-20、PBS、DMEM培养基，胰蛋白酶(购自Gibico公司);限制性内切酶NheI连接酶，DNA marker DL 2000均(购自TaKaRa公司); Trizol，LipofectamineTM2000，Alex568标记的山羊抗人IgG均(购自Invitrogen公司);兔源抗AQP4多克隆抗体，罗丹明标记的山羊抗兔IgG(购自Millipore公司)，多聚赖氨酸(购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司)；牛血清白蛋白(购自上海远慕生物科技有限公司)；多聚甲醛(购自上海抚生实业有限公司)，6孔板、琼脂糖、质粒提取试剂盒(Sant Cruz)，荧光显微镜XSP-63X(购自奥林巴斯，日本)；紫外凝胶成像仪(购自Vilber Lourmat 公司，法国)；紫外分光光度仪(购自ShimadzuUV-2201型，日本)；电泳仪(购自北京东方仪器厂)；流式细胞仪(购自德国Thermo电器公司)。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法：2组患者均予以维生素C、硫唑嘌呤等口服常规治疗，肾上腺皮质激素组患者在常规治疗的基础上给予肾上腺皮质激素治疗，500～1000 mg/d，静脉滴注，连用3～5 d，后用大剂量泼尼松口服1 mg/d，早晨1次顿服，持续4～6周，之后缓慢减量，缩至5 mg/周，直至减完。患者当天抽取 5 mL 静脉血，经超速离心，取上层血清置冻存管中于-80 ℃冰箱贮存。

1.3.2 稳定表达水通道蛋白-4的HEK293细胞株的建立：参考赵忙所[9]等建立的方法，本次试验操作如下：采用RT-PCR将总RNA扩增为AQP4的cDNA，以此为模板扩增AQP4基因。①获取AQP4基因：AQP4亚型a扩增的上游引物为：5’-CCTAGCTAGCGATGAGTGACAGACCCACAGC-3’，内含NheI酶切位点;下游引物为： 5’-TCCGCTCGAGTACTGAAGACAATACCT-CTCC-3’，内含NheI酶切位点；②鉴定并构建重组质粒：AQP4亚型a和质粒pEGFP-N1分别以限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ37 ℃双酶切过夜， T4连接酶16 ℃连接4～5 h，连接产物转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α，终浓度为5 mg/L的硫酸卡那霉素抗性LB平板培养过夜，提抽质粒，PCR、双酶切鉴定，阳性克隆送检测序鉴定；③进行细胞转染和抗生素筛选；将重组质粒转染到HEK293细胞中，同时以空质粒pEGFP-N1为对照。终浓度为800 mg/L的G418筛选稳定表达株，时间为14d，以后400 mg/L维持；④联合流式细胞仪筛选稳定表达株：为了提高稳定转染率，应用流式细胞仪分选，激发光波长为488 nm；⑤用间接免疫荧光法测定AQP4的表达：将生长至50%～70%HEK293细胞置于多聚赖氨酸处理玻片时，多聚甲醛固定，封闭，抗体反应，荧光显微镜下观察；⑥定位AQP4-GFP融合蛋白的细胞：于488 nm激光共聚焦显微镜下观察细胞株AQP4-GFP融合蛋白是否具有膜定位效应；⑦检测脊髓炎患者血清中AQP4抗体的顺序进行相关细胞株的建立。期间应注意在筛选稳定表达株时，激光波长为488 nm，而在荧光下测定AQP4的表达时，其激光的波长则以420～490 nm(蓝光)和535～550 nm(绿光)为佳，以达到促进细胞的转染和提高鉴定准确性的目的。

1.3.3 NMO-IgG的检测：采用质量浓度为0.1 g/L的多聚赖氨酸浸泡事先准备好的盖玻片，浸泡时间为(30±5)min，盖玻片的规格为23 mm×23 mm，热风吹干，在6孔细胞培养板内放置盖玻片。迅速在培养板中放置上述方法建立的稳定表达AQP4的HEK 293细胞株(1×105个/mL)，接着进行一般模式的培养(DMEM培养基)，当细胞与培养板接触面积达55%～75%时，则去除其中的DMEM培养液，期间应注意避免感染，然后用含有40 g/L多聚甲醛的PBS固定液进行细胞的固定，固定时间为15 min，温度为室温，PBS洗涤液进行3次洗涤；牛血清白蛋白的PBS封闭液在室温下孵育上述已固定好的细胞，孵育时间为2 h。

将患者血清用牛血清白蛋白的PBS封闭液进行等倍稀释，然后在室温下缓慢加入到上述固定的细胞中，2 h后重复上述步骤，每份样品重复2次；将体积分数为0.01%的表面活性剂吐温-20与PBS洗涤液进行混匀，然后对上述稀释好的细胞进行等量的3次洗涤，接着再用含30 g/L牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液稀释Alex568标记的山羊抗人IgG(1:4000)，培养时间为1 h，温度为室温；用上述配制好的PBS洗涤液再次进行3次洗涤；完成后在10 min之内将其进行荧光检测，依据国际标准[7]转染重组质粒的细胞，抗原抗体反应后荧光显微镜下观察，激发光为蓝光(420～490 nm)时，细胞表面呈绿色荧光;激发光为绿光(535～550 nm)时，细胞表面呈现为红色荧光，2者于细胞膜的位置重合良好，重合后呈黄色，阳性细胞强绿光，阴性为不着色的或者呈红色。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对所有数据进行分析，样本率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP4绿色荧光蛋白融合蛋白的细胞定位 在激发光波长为488 nm条件下，转染空质粒pEGFP-N1的HEK293细胞内GFP充满整个细胞，无明显的局部定位;转染重组质粒的HEK293细胞绿色荧光明显定位于细胞膜区域，并且表达量比较高。见图1。

图1 AQP4-GFP融合蛋白的细胞定位(×600)Fig.1 Cellular localization of AQP4-GFP fusion protein(×600)

2.2 血清NMO-IgG检测 患者血清NMO-IgG免疫荧光检测阳性、阴性结果见图2。30例视神经脊髓炎患者血清NMO-IgG阳性19例(63.3%)，血清抗体滴度检测范围为1:115～1:6355。血清NMO-IgG检测的灵敏度和特异性分别为45.5%和100%，肾上腺皮质激素组NMO-IgG的阳性率为86.7%(13/15)，对照组NMO-IgG的阳性率为40.0%(6/15)。肾上腺皮质激素组视神经脊髓炎患者血清NMO-IgG阳性率与对照组比较差异有统计学意义(χ2=7.03，P<0.05)，见表1。

图2 患者血清NMO-IgG免疫荧光定性检测结果(×400)Fig.2 Results of serum NMO-IgG measured by immunofluorescence qualitative(×400)

组别NMO-IgG阳性例数NMO-IgG阴性例数阳性率(%)对照组6940.0肾上腺皮质激素组13286.7

3 讨论

伴随实验技术的发展，NMO中NMO-IgG的致病作用逐渐被研究人员所熟知，为临床提供了NMO鉴别和诊断的依据。体外研究表明，人星形胶质细胞能够与NMO-IgG特异性结合并引起水通道蛋白-4可逆性内陷[10-11]。且在人体的胃部和肾脏中多有发现，但在NMO患者的肾脏和胃部中未曾发现。此外，在水通道蛋白-4的定位研究中报道其高密度分布在患者的大脑皮层、隔核和小脑颗粒细胞层等处[12-13]。Lennon等[4]报道了在大鼠实验中，采用间接免疫荧光法检测NMO患者体内存在特异性的NMO-IgG，且其灵敏度和特异性分别为73%和91%。

患者的临床表现、NMO-IgG和核磁共振检查为视神经脊髓炎的主要鉴别诊断途径，Matsuoka等[14]在参考了Lennon法的前提下对其相对特异性和灵敏度进行了计算，结果分别为100%和83.3%，此结果表明以AQP4为底物进行检测，此方法简单、有效、可靠。并且，此次结果与Jarius[15]、Papeix[16]、Shimizu[17]、Warabi等[18]的研究结果相一致。

近些年研究表明，NMO-IgG可以在患者体内血清中检出且复发时其滴度升高[19]。在本次研究中，NMO患者的IgG滴度低于国外文献中报道的1:12800[20]，分析其原因，可能为在本次研究所选用的荧光显微镜的灵敏度(45.5%)显著低于其他文献中的激光共聚焦显微镜，故而其所检测出来的滴度会明显偏低。且Weinstock-Guttma等[7]研究报道了患者体内的IgG阳性与患者的疾病活动能力呈正相关的趋势，当患者处于抑制剂治疗时其体内的IgG呈阴性，其他时期为阳性。此外，肾上腺皮质激素可以和细胞浆糖皮质激素受体特异性结合从而发挥其抗炎作用。且在其发生抗炎作用的同时其作用途径存在着复杂的联系，如其在不同的细胞系、作用时相或是不同程度的刺激下的作用强度亦不完全相同，关于肾上腺皮质激素的抗炎作用会成为其未来研究的重要靶点用于临床研究。

综上所述，随着科学技术的不断改进和医疗设备的不断完善，AQP4在临床检测的意义不断加深，它不但可以作为疾病活动能力的检测指标，也可以作为其治疗效果的评定标准，而NMO-IgG的发现更为此提供了规范化的检测标准，使得本课题组对AQP4了解和掌握加深了一个层次，为今后的临床研究奠定了基础，提供了指导性建议。

[1] Whiting KP,Restall CJ,Brain PF.Steroid hormone-induced effects on membrane fluidity and their potential roles in non-genomic mechanisms[J].Life sciences,2000,67(7):743-757.

[2] Croxtall JD,Choudhury Q,Flower RJ.Glucocorticoids act within minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through a receptor-dependent,transcription-independent mechanism[J]. Br J Pharmacol,2000,130(2):289-298.

[3] 崔志新，陈伟杰.小剂量糖皮质激素对严重感染性休克患者乳酸清除率及预后的影响[J].实用医学杂志，2012，28(18)：3055-3057.

[4] Lennon VA,Wingerchuk DM,Kryzer TJ,et al.A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis[J].Lancet,2004,364(9451):2106-2112.

[5] Lennon VA,Kryzer TJ,Pittock SJ,et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel[J].J Exp Med,2005,202(4):473-477.

[6] Ghezzi A,Bergamaschi R,Martinelli V,et al.Clinical characteristics,course and prognosis of relapsing Devic’s neuromyelitis optica[J].J Neurol,2004,251(1):47-52.

[7] Weinstock-Guttman B,Miller C,Yeh E,et al.Neuromyelitis optica immunoglobulins as a marker of disease activity and response to therapy in patients with neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2008,14(8):1061-1067.

[8] Wingerchuk DM,Hogancamp WF,O’brien PC,et al.The clinical course of neuromyelitis optica (Devic’s syndrome)[J].Neurology,1999,53(5):1107-1114.

[9] 赵忙所，孙朝晖，耿同超.稳定表达水通道蛋白-4 HEK293细胞株的建立及应用[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26(1)：68-70.

[10] Hinson SR,Roemer SF,Lucchinetti CF,et al.Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2[J].J Exp Med,2008,205(11):2473-2481.

[11] Vincent T,Saikali P,Cayrol R,et al.Functional consequences of neuromyelitis optica-IgG astrocyte interactions on blood-brain barrier permeability and granulocyte recruitment[J].J Immunol,2008,181(8):5730-5737.

[12] Costa C,Tortosa R,Domènech A,et al.Mapping of aggrecan,hyaluronic acid,heparan sulphate proteoglycans and aquaporin 4 in the central nervous system of the mouse[J]. J Chem Neuroanat,2007,33(3):111-123.

[13] Weinshenker BG,Wingerchuk DM,Vukusic S,et al.Neuromyelitis optica IgG predicts relapse after longitudinally extensive transverse myelitis[J].Ann Neurol,2006,59(3):566-569.

[14] Matsuoka T,Matsushita T,Kawano Y,et al.Heterogeneity of aquaporin-4 autoimmunity and spinal cord lesions in multiple sclerosis in Japanese[J].Brain,2007,130(Pt 5):1206-1223.

[15] Jarius S,Probst C,Borowski K,et al.Standardized method for the detection of antibodies to aquaporin-4 based on a highly sensitive immunofluorescence assay employing recombinant target antigen[J].J Neurol Sci,2010,291(1):52-56.

[16] Papeix C,Vidal JS,Deseze J,et al.Immunosuppressive therapy is more effective than interferon in neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2007,13(2):256-259.

[17] Shimizu Y,Yokoyama K,Misu T,et al.Development of extensive brain lesions following interferon beta therapy in relapsing neuromyelitis optica and longitudinally extensive myelitis[J].J Neurol,2008,255(2):305-307.[18] Warabi Y,Matsumoto Y,Hayashi H.Interferon beta-1b exacerbates multiple sclerosis with severe optic nerve and spinal cord demyelination[J].J Neurol Sci,2007,252(1):560-561.

[19] Jarius S,Aboul-Enein F,Waters P,et al.Antibody to aquaporin-4 in the long-term course of neuromyelitis optica[J].Brain,2008,131(11):3072-3080.

[20] Saini H, Rifkin R, Gorelik M, et al. Passively transferred human NMO-IgG exacerbates demyelination in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. BMC Neurology, 2013, 13(10): 104.

(编校：王俨俨)

Effect of adrenocortical hormone on detection of NMO-IgG in neuromyelitisoptica patients

GAO Wen-yong

(Department of Neurology, Hankou Hospital of Wuhan, Wuhan 430010, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of adrenocortical hormone on detection of NMO-IgG in neuromyelitis optica (NMO) patients. Methods30 cases with NMO collected in the hospital according to the figures were randomly divided into adrenocorticotropic hormone group and control group, 15 cases in each group. adrenocorticotropic hormone group were given glucocorticoid therapy on the basis of conventional therapy. The control group were treated with conventional therapy, and The serum NMO-IgG levels were detected by indirect immunofluorescence taking stable expression of human origin aquaporin -4 (AQP4) in human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line as substrate. Results19 cases (63.3%) serum NMO-IgG positive patients in 30 cases with spinal cord inflammation, serum antibody titers from 1:115 to 1:6355. The positive rate of serum NMO-IgG in adrenocorticotropic hormone group was 86.7%, which was higher than 40.0% in control group (χ2=7.03，P<0.05). ConclusionThe adrenocortical hormone could help the detection of NMO-IgG antibody and increase the efficiency of clinical diagnosis.

adrenocortical hormone; neuromyelitis optica; NMO-IgG; aquaporin-4

高文勇，男，硕士，主治医师，研究方向：脑血管病及脊髓疾病诊治，E-mail: gwyhp07@163.com。

R972

A

1005-1678(2015)06-0130-04