Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集的遗传易感性关系

何承诚谢裕安赵瑞强毛赛兰闫雷黄正

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学研究生学院

临床研究

Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集的遗传易感性关系

何承诚1，2谢裕安1赵瑞强1，2毛赛兰1，2闫雷1，2黄正1，2

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学研究生学院

目的探讨广西扶绥县壮族Rac 1基因rs 6951997位点多态性与肝癌家族聚集的遗传易感性关系。方法以广西扶绥县壮族20个肝癌高发家族（肝癌家族组79例）和10个健康对照家族（健康对照家族组40名）为研究对象，应用飞行时间质谱技术（MALDI-TOFMS）检测两组中Rac 1基因rs 6951997位点的基因型及等位基因频率，以非条件logistic回归分析其多态基因型与肝癌发生危险性的关系。结果肝癌家族组Rac 1基因rs 6951997位点的GT基因型的分布频率（6.30%）高于健康对照家族组（2.50%），二者差异无统计学意义（OR=3.76，95%CI∶0.28～51.45，P=0.32）。其位点等位基因T型、G型在肝癌家族组中的分布频率分别为96.83%、3.16%，在健康对照家族组中的分布频率分别为98.75%、1.25%，两组差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结论Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集的遗传易感性未有显著相关。

肝肿瘤；Rac 1基因；单核苷酸多态性；家族聚集；遗传易感性

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC，简称肝癌）是我国最常见的恶性肿瘤之一。广西扶绥县是我国肝癌高发区之一，2004～2008年肝癌发病率为67.26/10万［1］，该县肝癌占全部恶性肿瘤的57.01%，居恶性肿瘤的首位［2］。肝癌发病具有明显的家族聚集倾向，遗传因素在家族聚集性肝癌中具有重要作用［3］。目前有关肝癌基因多态性与广西扶绥县肝癌家族遗传易感性的研究已有部分报道［4］。Rac 1基因称为Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1），是多种信号传导通路的“分子开关”，目前已在肺癌［5］、恶性黑色素瘤、部分乳腺癌以及胰腺癌等多种肿瘤中发现Rac 1基因变异，并引发肿瘤［6］。王云等［7］研究发现Rac 1基因与肝癌的发生、发展密切相关，但Rac 1基因rs 6951997位点在肝癌方面的研究鲜见报道。本研究以广西扶绥县壮族肝癌高发家族为研究对象，探讨Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西壮族肝癌家族聚集的遗传易感性关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物科技有限公司），iplex®Gold Reagent Kit试剂盒、MassArray Assay Designer 3.1 software、MassArray Samsung NanodispenserRS1000点样仪、MassArray Analyzer Compact质谱系统（均为美国Sequenom公司），PCR扩增引物、单碱基延伸引物（深圳华大基因公司）。

1.2 研究对象

肝癌高发家族（以下简称“肝癌家族”）是指在先证者的血缘直系亲属中，至少有1例或1例以上的肝癌患者，要求所有肝癌患者均分布在三代家族之内（含先证者）。健康对照家族组是指扶绥县当地与肝癌家族居住在同一个村庄且无血缘关系的家族成员。

本研究以20个肝癌家族（肝癌家族组79例）和10个健康对照家族（健康对照家族组40名）为研究对象，均为广西扶绥县壮族人群。肝癌家族组由肝癌患者及其有血缘关系的直系亲属组成，其中肝癌患者为2003年1月至2011年10月在广西医科大学附属肿瘤医院进行外科手术的患者，术后经病理检查确诊，术前均未经放疗、化疗或生物治疗，均经病史采集显示其直系亲属中至少已有1人确诊为肝癌。肝癌家族组79例中男45例，女34例，中位年龄44岁（16～86岁）；H月sAg（+）50例，H月sAg（-）29例；AFP（+）14例，AFP（-）65例；吸烟17例，不吸烟（＜10支/日）62例，饮酒64例，不饮酒（＜100g/日）15例。健康对照家族组选自在当地县医院进行健康体检的家系人群，体检结果均为正常。无肝炎病史、肿瘤病史及遗传病史。该组40名中男26名，女14名，中位年龄47岁（16～85岁）。吸烟者15名，不吸烟（＜10支/日）25名；饮酒者17名，不饮酒（＜100 g/日）23名。采集入选研究对象晨起空腹静脉血液5ml。按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，所有入选者均知情并同意参加本研究。

1.3 DNA提取

实验分析Rac 1基因型的基因组DNA，以天根生化科技（北京）有限公司生产的试剂盒，提取手术切除的肝癌组织（20例）标本的DNA。采用血液DNA提取试剂盒提取肝癌患者直系亲属（59名）及健康对照家族组（40名）静脉血液标本的DNA，经分光光度计定量分析，OD值1.7～2.1认定为DNA纯度合格。将质检合格的DNA浓度调整到50μg/μl，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4 基因型分析

由深圳华大基因公司的Sequenom实验平台，采用美国Sequenom公司的MassArray飞行时间质谱技术分析所有研究对象DNA的单核苷酸多态性（SNP）的基因分型，以TYPER 4.0软件分析实验结果获得基因分型数据。

1.4.1 引物设计及合成引物设计基因引物应用美国Sequenom公司Assay Designer 3.1 software设计，每个SNP位点对应两条PCR扩增引物和一条延伸引物，Rac 1基因上游引物为5′-GCATTTAATTCATCTTTAAACTGGTG-3′，下游引物为5′-GCATTTAATTCATCTTTAAACTGGTT-3′，延伸引物为5′-GCATTTAATTCGCATTTTTCATCTTTAAACTGGT-3′，引物均由深圳华大基因公司合成。

1.4.2 PCR扩增、SAP纯化、引物延伸及芯片点样使用热启动Taq酶（美国Agena月ioscience公司）在384孔板上，常规扩增待测片段（40个循环），然后在PCR产物中加入2μl碱性酸化酶（SAP，美国Sequenom公司）消化液（双蒸水1.53μl、hME缓冲液0.17μl、 SAP 0.474 U）以除去未用尽的dNTP，消化反应为37℃60 min；85℃10 min。然后根据Sequenom程序进行引物延伸反应和延伸产物纯化反应，用纳升点样仪将纯化后的产物分点在质谱微阵列芯片上（Spectro CHIP，美国Agena月ioscience公司）［8］。

1.4.3 飞行时间质谱技术（MALDI-TOFMS）检测SNP位点采用Sequenom MassArray平台对Rac 1基因进行SNP分型，以TYPER 4.0软件分析实验结果获得基因分型数据。根据引物延伸反应产物质谱峰的位置确定其分子质量，从而得出SNP基因分型结果；同时根据质谱峰的信噪比、峰尖的位置、峰的宽度等参数判定高质量、中等质量和低质量三种基因分型结果。同一种颜色可以对应2个或3个峰值，分别为SNP位点的延伸引物峰及两个等位基因峰，若该位点属于纯合子，则仅存在1个等位基因峰；若为杂合子，则存在2个等位基因峰［8］。

1.5 统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计学分析。以χ2检验比较两组年龄、性别、基因型和等位基因分布频率的差异。采用拟合优度χ2检验法进行健康对照家族组基因型分布的Hardy-Weinberg遗传平衡检验，判断研究对象是否具有人群代表性。用χ2检验和非条件logistic回归分析法计算比值比（OR）及95%可信区间（95%CI）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般情况

本研究收集肝癌家族组79例和健康对照家族组40名。肝癌家族组中男性45例，女性34例；健康对照家族组中男性为25名，女性为15名，两组性别差异无统计学意义（χ2=2.54，P=0.28）。肝癌家族组年龄为16～86岁，其中59例≤55岁，20例＞55岁；健康对照家族组年龄为16～85岁，其中25例≤55岁，15例＞55岁；两组年龄差异无统计学意义（χ2=1.90，P=0.168），具有可比性。

2.2 基因型检测结果

本研究119例样本中Rac 1基因rs 6951997位点存在GT型、TT型两种基因型，GG型缺失。其中GT基因型113例、TT基因型6例。见图1（A、月）。

图1 Rac 1基因rs 6951997 SNP位点基因型的GT、TT分型

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

为了检验Rac 1基因rs 6951997位点基因型的频率是否遵循遗传平衡定律，在健康对照家族组中进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。结果表明，基因型频率的观察值与期望值之间的差异无统计学意义（χ2=0.01，P=0.94）。提示其Rac 1基因rs 6951997位点基因型频率符合遗传平衡，具有广西壮族人群代表性。见表1。

2.4 Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西肝癌家族聚集遗传易性的关系

Rac 1基因rs6951997位点的TT型、GT型在肝癌家族组中的分布频率分别为93.67%、6.30%，在健康对照家族组中分别为97.50%、2.50%。肝癌家族组中GT基因型的分布频率明显高于健康对照家族组，但差异无统计学意义（OR=2.64，95%CI∶0.30～23.35，P=0.38），经性别、年龄、吸烟、饮酒、H月sAg、AFP等因素校正后患肝癌的风险仍然升高（OR=3.76，95%CI∶0.28～51.45，P=0.32）。与TT基因型相比，GT基因型在肝癌家族组和健康对照家族组间分布频率的差异无统计学意义（P=0.32）。等位基因T型与G型在肝癌家族组中的分布频率分别为96.83%、3.16%，在健康对照家族组中的分布频率分别为98.75%、1.25%，等位基因T型、G型在两组间分布频率的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 Rac 1基因rs 6951997位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表2 Rac 1基因rs 6951997位点的基因型及等位基因在两组间的分布及危险度分析［n（%）］

3 讨论

研究表明，SNP在人群中发生的频率大于1%，可能引起携带者对疾病易感性的改变［9］。Rac 1称为Ras相关的C3肉毒素底物1，人Rac 1基因位于第7号染色体的P22，由长约29 Kb的7个外显子组成。Rac 1基因的输出蛋白Rac 1酶是一种Rho GTP酶，以非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式进行循环，起着多条信号传导通路的“分子开关”作用。Rac 1蛋白通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡而导致肿瘤形成［10］，激活的Rac 1及其GTPase活化蛋白RacGAP能与信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators oftranscription，STAT3）形成复合物，诱导其酪氨酸磷酸化，然后STAT转位进入细胞核，激活靶基因，开启细胞转录。Rac 1也能影响肿瘤的侵袭、转移，以及肿瘤血管的生成［11］。目前在纤维肉瘤患者的癌细胞中研究发现Rac1基因变异，作为癌基因而发挥作用，已成为纤维肉瘤的主要致癌病因。另外在恶性黑色素瘤、部分乳腺癌以及胰腺癌等6种肿瘤中，也发现Rac 1基因变异。约5%的黑色素瘤患者和约3%的乳腺癌患者体内发现该基因变异。且已在动物实验中确认，实验鼠被植入变异基因的部位出现了纤维肉瘤［6］。

研究表明，Rac 1蛋白在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中的表达有较大差异，肝癌组织中Rac 1蛋白的表达显著高于癌旁组织，癌旁组织中的表达显著高于正常肝组织，Rac 1基因的表达产物为Rac 1蛋白，其与肝癌的侵袭、转移能力呈正相关［12，13］。提示Rac 1基因位点多态性与肝癌发生显著相关［14］。

在肝癌发生的多阶段过程中，基因多态性可决定肝癌发生的易感性，对其进行筛查、鉴别有助于预测肝癌高危人群［15，16］。目前尚无有关Rac 1基因rs6951997位点多态性与肝癌遗传易感性的研究报道，尤其在肝癌家族聚集性方面。本研究首次探讨了Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集遗传易感性关系。研究结果显示，肝癌家族组中GT基因型分布高于健康对照家族，比TT基因型患肝癌的风险高2.64倍，但差异无统计学意义（P＞0.05）。经性别、年龄、吸烟、饮酒、H月sAg、AFP等因素校正后，肝癌家族组中GT基因型分布仍高于健康对照家族，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与TT基因型相比，GT基因型在肝癌家族组和健康对照家族组间的分布频率差异无统计学意义。提示Rac 1基因rs 6951997位点GT基因型不是广西扶绥县壮族肝癌高发家族聚集发病的易感基因型，Rac 1基因rs 6951997位点多态性可能与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集遗传易感性无关联。研究结果与以往认为Rac 1基因rs 6951997位点多态性与黑色素瘤的发生、发展无关的观点相似［17］。本研究未发现Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集的遗传易感性有显著相关性，其原因可能为收集的肝癌病例数较少，且健康对照数也偏少，可能使预期实验结果产生一定的偏离。因此，需扩大样本数量进一步深入研究。

综上，本研究初步探讨了Rac 1基因rs 6951997位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族聚集的遗传易感性关系，结果未发现Rac 1基因rs 6951997位点多态性与该县壮族肝癌高发家族聚集的遗传易感性有显著相关，这对了解肝癌的发病机制及肝癌高危人群的筛检将提供实验佐证，有关方面值得深入研究。

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［2015-01-05收稿］［2015-03-05修回］［编辑阮萃才］

Relationship between the rs 6951997 polymorphism in the Rac 1 gene and genetic susceptibility to hepatocellu lar carcinom a in fam ilial clusters of liver cancer among the Zhuang peop le of Fusui County，Guangxi

HE Chengcheng1，2，XIE Yu’an1，ZHAO Ruiqiang1，2，MAO Sailan1，2，YAN Lei1，2，HUANG Zheng1，2（1Research Department of Guangxi Cancer Institute；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

XIE Yu′an.E-mail：gxxya@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the correlation between the rs 6951997 polymorphism in the gene encoding Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1（Rac 1）and familial clustering of genetic risk of primary liver cancer in the Zhuang population in Fusui County，Guangxi.M ethodsGenotype and allele frequencies at the rs 6951997 polymorphism were determined in 20 families（n=79 individuals）with liver cancer and in 10 healthy control families（n=40 individuals）using time-of-flightmass spectrometry.Non-conditional logistic regression was used to identify relationships between gene polymorphisms and risk of hepatocarcinogenesis.ResultsThe GT genotype was slightly more frequent in patients from families with liver cancer than in normal controls，but the difference did not achieve significance（OR 3.76，95%CI 0.28 to 51.45，P=0.32）.The two groups of patients presented similar frequencies of the T allele（96.83%vs 98.75%）and of the G allele（3.16%vs 1.25%）（both P＞0.05）.ConclusionThe rs 6951997 polymophism in the Rac 1 genemay not be associated with family clustering of genetic susceptibility for primary liver cancer in the Zhuang population of Fusui County，Guangxi.

Liver neoplasm；Rac 1 gene；Single nucleotide polymorphism；Family clustering；Genetic susceptibility

R735.7

A

1674-5671（2015）02-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.07

国家自然科学基金资助项目（81260320）；广西优秀博士学位论文培育项目（YC月Z2013012）

谢裕安。E-mail：gxxya@aliyun.com