A2M介导Fas信号传导途径提高卵巢癌对铂类化疗的敏感性研究

李梦迪石丽君刘红梅阳志军潘忠勉李力2,王琪

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）；3广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；4广西医科大学研究生学院

基础研究

A2M介导Fas信号传导途径提高卵巢癌对铂类化疗的敏感性研究

李梦迪1，4石丽君1，4刘红梅1，4阳志军2，3潘忠勉3李力2,3王琪1，2

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）；3广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；4广西医科大学研究生学院

目的探讨A2M基因的表达与卵巢癌患者耐药及预后的关系及其对Fas信号传导通路的影响。方法利用癌症基因图集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中铂类敏感和耐药的卵巢癌患者的基因表达谱，分析A2M基因在铂类敏感和耐药患者中的表达差异。利用已构建的带有绿色荧光标记的卵巢癌SKOV3敏感细胞（SKOV3-GFP）和顺铂耐药细胞（SKOV3-GFP/DDPⅡ）进行裸鼠皮下种植，成瘤后分次予以顺铂体内干预，以实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技术检测不同次数顺铂干预后的肿瘤组织中A2M mRNA与Fas信号传导通路上重要节点基因的表达水平。用双变量线性回归分析A2M mRNA与所检测基因的表达量的相关性。结果相对于铂类敏感病例，A2M mRNA在铂类耐药患者中的表达下降（P＜0.05），A2MmRNA的表达与耐药相关（P=0.02），与卵巢癌患者总生存期、化疗间隔生存期和无疾病进展生存期高度相关（P均＜0.001），其表达量越高，患者生存期越长。A2M mRNA以及细胞凋亡相关的Fas信号传导通路上重要节点基因Fas、FADD、caspase10、caspase9和caspase3随顺铂注射次数的增加，在耐药的移植瘤组织中相对低表达（P＜0.001）；而其下游与DNA修复相关的基因PARP1随顺铂注射次数的增加，在耐药的移植瘤组织中相对高表达（P＜0.05）。A2M mRNA的表达与Fas信号传导通路上节点基因的表达存在线性相关（P＜0.05）。结论A2M可能是卵巢癌顺铂耐药的潜在信号分子，它可能维持肿瘤细胞对铂类药物的敏感性。其在耐药细胞中的低表达可能通过某种机制抑制下游的Fas信号传导通路，使其传导失调，最终引起PARP1的表达上调，促进DNA修复，抑制细胞凋亡，诱发卵巢癌细胞对顺铂的耐药。

卵巢肿瘤；顺铂耐药；A2M；Fas信号传导通路；癌症基因图集

铂类药物是目前临床上治疗卵巢癌的一线化疗药物。而临床上约80%的卵巢癌患者在多次化疗后产生铂类获得性耐药，严重影响了患者的预后，产生耐药后的患者5年生存率仅为20%［1］。研究表明，铂类获得性耐药产生是一个时间依赖的生物学过程［2］。已知的铂类药物耐药机制主要包括：DNA修复能力的提高；药物在肿瘤细胞内蓄积减少，包括细胞摄入药物减少和药物主动外排增加；肿瘤细胞对抗肿瘤药物的转化和解毒功能增强；细胞凋亡传导通路上调节蛋白的表达改变等。众所周知，Fas信号传导通路对细胞凋亡起关键性作用。有研究表明，抑制肿瘤细胞的Fas基因后，下游信号传导通路同样被抑制，并能增强细胞毒性化疗药物对卵巢癌细胞的毒性，可逆转卵巢癌细胞对化疗的耐受［3］。

本课题组在前期模拟临床耐药的过程中，通过活体内连续诱导，建立了裸鼠卵巢癌的顺铂（DDP）耐药模型，并获得顺铂获得性耐药的SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞株［4］。继之我们对SKOV3-GFP/DDPⅡ耐药过程进行动态的生物学分析，整和基因表达谱、microRNA谱及蛋白质谱三个水平的数据信息后，筛选到α2巨球蛋白（A2M）在耐药细胞中均显著降低。据文献报道，A2M是血液中的一种大分子血浆蛋白。月irkenmeier等［5］认为老年人血液A2M水平的下降与肿瘤发病率高度相关；最近研究表明，A2M与其细胞膜受体LRP1结合可抑制Wnt/β-catenin肿瘤信号传导途径［6］。

在以上研究成果的基础上，我们利用癌症基因图集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库进一步分析了A2M基因的表达与卵巢癌化疗耐药的相关性。并采用SKOV3-GFP和SKOV3-GFP/DDPⅡ两种细胞株进行裸鼠皮下种植成瘤，对移植瘤分次进行体内顺铂干预，对所获肿瘤组织进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测，研究了A2M和Fas凋亡信号传导通路上重要节点基因在铂类敏感组织和耐药组织中的表达变化，并对二者的相关性进行了探讨，试图推测A2M是否有助于维持卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性及其表达变化是否能通过影响下游的Fas信号传导通路抑制细胞凋亡，从而诱发肿瘤细胞耐药。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株及实验动物：SKOV3-GFP细胞株为带有绿色荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）绿色荧光标记的卵巢癌SKOV3亲本细胞，SKOV3-GFP/DDPⅡ为本课题组前期在裸鼠体内由顺铂诱导的DDP耐药细胞株，耐药指数为2.42倍［4，7］。裸鼠（SPF级，月al月/C）由广西医科大学动物实验中心提供（实验动物合格证号：NO.1011131），均为4周龄左右的雌性裸鼠，体重为18～20 g。

主要试剂：顺铂为山东齐鲁制药有限公司生产，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Corning公司。Trizol Reagent为美国Invitrogen公司产品，M-MLV Reverse Transcriptase由美国Promega公司提供，SY月R Premix Ex TaqⅡ购自日本Takara公司，基因引物由美国Invitrogen公司合成，实时荧光定量PCR仪为美国生产（A月I7300型）。

数据来源：TCGA数据库是目前世界上最大的癌症基因数据库，由英国帝国理工大学HaniGabra教授惠赠，含497例卵巢癌患者的全基因表达谱数据及临床预后资料，患者的临床资料见文献［8］。其中卵巢癌铂类耐药89例，铂类敏感165例，未确诊铂类耐药243例。

1.2 实验方法

1.2.1 裸鼠皮下移植瘤铂类耐药模型按本课题组前期研究的方法［4］，以10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMED培养基，37℃、5%CO2培养SKOV3-GFP和SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞至对数生长期。以1×107个细胞的密度接种于裸鼠的腹股沟皮下，种植8 d后观察成瘤情况。用游标卡尺测量肿瘤最长直径（a）与最短直径（b），待肿瘤体积（0.52×a×b2）长至400 mm3时，开始予隔日腹腔注射DDP（剂量为2.5 mg/kg，共8次），每组4只裸鼠。分别在第2次、第5次、第6次注射后的次日取出瘤块，对照组分别为无顺铂处理的移植瘤。

1.2.2 qRT-PCR检测Fas凋亡信号传导通路上节点基因mRNA的表达以Trizol法提取所得肿瘤组织的RNA，定量后逆转录为cDNA。qRT-PCR检测上述移植肿瘤组织cDNA中A2M、Fas凋亡信号转导通路上节点基因mRNA的表达。所检测基因的引物序列如表1，以GAPDH基因为内参。采用2-△△Gt法计算实验组目的基因的表达相对于对照组的表达倍数。

表1 所测基因引物序列

1.2.3 A2M mRNA的表达与卵巢癌铂类获得性耐药和患者预后的相关性分析利用TCGA数据库中铂类敏感和耐药的卵巢癌患者的基因表达谱，分析A2M基因在铂类敏感和耐药患者中的表达差异；Pearson相关分析A2M mRNA的表达量与卵巢癌患者临床耐药以及预后（包括患者总生存期、无疾病进展生存期和化疗间隔生存期）的相关性。

1.3 统计学分析

用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两比较采用Dunnett-t检验。以Pearson相关分析A2M mRNA的表达量与卵巢癌患者铂类耐药以及预后的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A2M mRNA表达量与卵巢癌铂类获得性耐药和患者预后的相关性分析

分析TCGA提供的89例卵巢癌铂类耐药患者和165例铂类敏感患者的全基因组表达谱数据。结果表明相对于铂类敏感病例，A2M mRNA在铂类耐药患者的表达下降（P＜0.05）（图1）；Pearson相关分析发现A2M mRNA的表达与卵巢癌患者临床耐药相关（P=0.02），与卵巢癌患者总生存期、化疗间隔生存期和无疾病进展生存期高度相关（P均＜0.001），其表达量越高，患者的生存期越长。

图1 A2M m RNA在卵巢癌铂类敏感和耐药患者中的表达比较

2.2 qRT-PCR检测A2M与Fas信号传导通路上节点基因mRNA的表达

以qRT-PCR检测与细胞凋亡密切相关的Fas信号传导通路上的重要节点基因的mRNA表达。结果表明，A2M mRNA在卵巢癌铂类敏感组织和耐药组织中的表达随顺铂注射次数的增多均呈现下降趋势。未进行顺铂注射时，A2M mRNA在铂类耐药组织中的表达较铂类敏感组织高2.0倍（P=0.001）。而经不同次数顺铂作用后，其在铂类耐药组织中的表达均低于铂类敏感组织，尤其在顺铂注射2次后，A2M mRNA的表达下调了4.7倍（P=0.001）；至顺铂注射6次后，A2M mRNA的表达在铂类敏感和耐药移植瘤组织中均较低，但是在后者中的表达相对于前者仍显著降低（P=0.045）。另外，随顺铂注射次数的增加，Fas信号传导通路上的Fas、FADD、caspase10、caspase9和caspase3在耐药移植瘤组织中的mRNA表达相对于敏感移植瘤组织亦均明显降低（P＜0.001），特别是在顺铂注射2次后，FasmRNA的表达下调了2.4倍（P=0.002），caspase9mRNA的表达下调了2.1倍（P=0.035），caspase3 mRNA的表达下调了2.1倍（P=0.043）；至顺铂注射6次后，FasmRNA的表达下调了3.7倍（P=0.001），FADD mRNA的表达下调了3.2倍（P=0.028），caspase10 mRNA和caspase9mRNA均下调2.0倍（P均=0.001）。而随顺铂注射次数的增加，在Fas信号传导通路下游与DNA修复相关的PARP1在耐药移植瘤组织中的mRNA表达相对于敏感移植瘤组织明显上调（P＜0.01），特别是顺铂注射6次后，上调了2.0倍（P=0.023）。各节点基因表达趋势的变化见图2。

图2 qRT-PCR检测A2M、Fas、FADD、caspase10、caspase9、caspase3和PARP1在裸鼠移植瘤中不同顺铂注射次数的m RNA相对表达量

2.3 A2M mRNA的表达与Fas信号传导通路上节点基因以及下游基因表达的相关性分析

将不同次数顺铂作用后的肿瘤组织中A2MmRNA的相对表达量与Fas信号通路上节点基因和下游PARP1的相对表达量分别进行双变量线性回归分析，结果显示A2MmRNA的表达变化与Fas信号传导通路上节点基因和下游PARP1的表达变化均存在相关性（P＜0.05）。见图3。

图3 双变量线性回归分析A2M mRNA与Fas、FADD、caspase10、caspase9、caspase3和PARP1在裸鼠移植瘤中相对表达量的相关性

3 讨论

在妇科肿瘤中卵巢癌发病隐匿，当肿瘤局限于卵巢时，仅约25%的患者可确诊［2］。到肿瘤晚期（FIGO分期为Ⅲ期和Ⅳ期），当病变扩展至卵巢外部时，约70%的患者确诊时已处于晚期，失去了最佳的治疗时机。以铂类药物（顺铂、卡铂、奥沙利铂）为基础结合紫杉醇类化疗药物的联合化疗是目前治疗卵巢癌的一线化疗方案［9］。尽管以顺铂治疗卵巢癌初期表现较敏感［10］，但仍有15%～20%的患者出现原发性耐药，而其余80%的患者虽然对铂类敏感，但可能在反复化疗过程中产生获得性耐药［11］。因此，深入探讨卵巢癌的多药耐药机制，有利于了解疾病的发生、发展过程，以采取针对性的治疗措施逆转化疗耐药，改善卵巢癌患者的预后和提高生存质量。

本课题组在前期研究的基础上，首先对A2M基因的表达与卵巢癌患者铂类耐药情况进行相关性分析。结果表明，相对于铂类敏感病例，A2M基因在铂类耐药患者的表达下降，并与卵巢癌患者的铂类耐药以及总生存期、无疾病进展生存期和化疗间隔生存期高度相关，其表达量越高，患者生存期越长。据此，我们初步认为A2M可能是与卵巢癌铂类耐药有关的重要因子，它可能维持卵巢癌患者对铂类化疗的敏感性。qRT-PCR检测结果表明，在裸鼠移植瘤中A2M mRNA的表达随顺铂注射次数的增多，相对于顺铂敏感组织，其在耐药组织中的表达呈现下降趋势。进一步比较发现，未进行顺铂注射时，A2M mRNA在耐药组织中的表达高于敏感组织2.0倍，而经不同次数顺铂作用后，其在耐药组织中的表达均低于敏感组织，特别是在顺铂注射2次后，A2M mRNA的表达显著下降，至顺铂注射6次后，A2M mRNA的表达在敏感组织和耐药组织中均很低，但相对于前者在后者中的表达仍表现出下调。以上结果提示A2M的表达随药物的作用出现了异常，从而更好地论证A2M可能与肿瘤细胞的铂类耐药有关这一推测。综合A2M的表达与卵巢癌患者铂类耐药的相关性分析，我们进一步认定A2M可能是与卵巢癌铂类耐药相关的潜在信号分子，它在肿瘤细胞中的低表达减弱了细胞对铂类药物的敏感性。而对Fas凋亡信号传导通路上节点各基因mRNA的表达进行qRT-PCR检测，结果显示Fas信号传导通路在耐药组织经顺铂作用后明显被抑制，而与DNA修复相关的PARP1mRNA出现了表达上调。另外，Fas通路上的Fas、caspase10、caspase9和caspase3以及下游的PARP1未进行顺铂注射时，在敏感组织和耐药组织中的mRNA表达无明显差异，而Fas、caspase9 mRNA和caspase3 mRNA的表达均在第2次顺铂注射后出现大幅度地下降。这种潜在的联系提示顺铂的干预可能是在改变了A2M的表达后影响Fas通路上节点基因mRNA的表达，继之上调了其下游与DNA修复相关的PARP1基因的表达。而对A2M的表达变化与Fas信号传导通路上节点基因和其下游基因的表达变化进行线性回归分析，结果进一步证实了A2M的表达变化与Fas信号传导通路存在一定联系。

文献报道，A2M作为血液中的一种大分子血浆蛋白，主要是通过抑制血液纤维蛋白溶酶和激肽释放酶的活性来发挥抑制纤维蛋白溶解的功能，也可作为载体蛋白与许多生长因子和细胞因子，如血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF-1）和白细胞介素等结合［12］。Lauer等［13］认为A2M与生长因子结合，灭活了TGF-β1等已知的促肿瘤增殖因子，而抑制肿瘤生长和侵袭。Lillis等［14］证明A2M与其受体LRP1结合后能清除TGF-β1等其他生长调节配体。A2M和LRP1结合后还能吞噬多种基质金属蛋白酶，如MMP-2等而抑制细胞迁移和侵袭［15］。据此，我们认为A2M可能是通过与LRP1结合而有助于机体自身免疫能力的维持，可促使铂类药物进入肿瘤细胞，通过Fas途径诱导细胞凋亡，在一定程度上维持了肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性。在临床上，卵巢癌患者由于长期进行化疗，血浆中A2M下降后，其与LRP1的结合相对减弱，从而使Fas凋亡通路被抑制，细胞对药物的敏感性减弱，导致细胞耐药。本实验研究也证实卵巢癌细胞耐药时，A2M与Fas信号传导通路上节点基因的表达均显著下调，从而印证了以上推测。

综上，我们推测A2M作为潜在的铂类耐药上游调控信号分子，直接或间接影响卵巢癌的肿瘤微环境，调控着微环境中某些细胞生长因子以及下游的叶酸代谢和凋亡信号通路，并能以某种方式激活细胞内Fas凋亡信号传导通路，维持卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性。在顺铂反复作用下，卵巢癌细胞中A2M基因的表达降低，通过与肿瘤微环境中某些细胞因子或趋化因子的相互作用，抑制了细胞内Fas凋亡信号传导通路，使其调控下游的DNA修复功能增强，从而抵抗顺铂诱导的细胞凋亡，促进癌细胞增殖，使肿瘤细胞产生耐药性。亦即A2M可能介导Fas信号传导通路，从而提高卵巢癌患者对铂类药物的敏感性。但有关耐药相关信号分子的表达异常后，具体是通过哪些细胞因子的协助以及如何与下游信号通路相互作用诱导了细胞对药物的耐受，其机制仍需深入研究和证实。

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［2015-01-20收稿］［2015-03-09修回］［编辑阮萃才］

Association between A2M-induced Fas apop totic signaling and ovarian tumor sensitivity to p latinum-based chemotherapy

LIMengdi1，4，SHILijun1，4，LIU Hongmei1，4，YANG Zhijun2，3，PAN Zhongmian3，LILi2，3，WANG Qi1，2（1Research Department of Guangxi Cancer Institute；2Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Prevention Treatment，Ministry of Education；3Department of Gynecological Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；4Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

ObjectiveTo analyze the relationship of A2M-induced Fas signaling to drug resistance of ovarian cancer and to patient prognosis.M ethodsWe used gene expression profiles in the Cancer Genome Atlas to search for correlations of A2M expression with drug resistance of ovarian cancer and with patient prognosis based on Pearson correlation analysis.Cisplatin-sensitive or-resistant SKOV3 ovarian cancer cells expressing green fluorescent protein were inoculated subcutaneously into nude mice.At different timesafter cisplatin administration，tumor tissues were analyzed using real-time fluorescent quantitative PCR to determine expression of A2M and key node genes in the Fas pathway.Correlation between A2M expression and expression of node geneswas examined using linear regression.ResultsA2M correlates significantly with drug resistance of ovarian cancer（P=0.020）.A2M was expressed at significantly lower levels in platinum-resistant tissue than in platinum-sensitive tissue（P＜0.05），and higher A2M levels correlated significantly with longer platinum-free interval，overall survival，and progression-free survival（P＜0.001）.Platinum-resistant transplanted tumors expressed significantly lower levels of A2M and the apoptosis-related node genes Fas，FADD，Caspase10，Caspase9 and Caspase3 than did platinum-sensitive tumors（P＜0.001）.The downstream gene PARP1，important for DNA repair，was expressed at a significantly higher level in platinum-resistant tumors（P＜0.05）.Expression of A2M correlated linearly with that of node genes of the Fas signaling pathway（P＜0.05）.ConclusionsA2M may be amarker of cisplatin resistance in ovarian cancer.Lower levels of A2M expression may up-regulate expression of the DNA repair protein PARP1，inhibiting cell apoptosis and ultimately leading to cisplatin resistance.

Ovarian neoplasm；Cisplatin resistance；A2M；Fas signal transduction pathways；The cancer genome atlas

R737.31

A

1674-5671（2015）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.01

国家自然科学基金资助项目（81360341）;广西自然科学基金资助项目（2013GXNSFAA019248）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com