m iR-144对肝癌细胞生物学功能的影响及其临床意义

黄超源黄馨萍李先建朱继业陈志刚黄山赵荫农连芳邬国斌

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学研究生学院；3广西医科大学生理学教研室

基础研究

m iR-144对肝癌细胞生物学功能的影响及其临床意义

黄超源1，2黄馨萍1李先建1朱继业1陈志刚1黄山1赵荫农1连芳3邬国斌1

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学研究生学院；3广西医科大学生理学教研室

目的探讨miR-144在肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞生物学功能的影响，并分析其临床意义。方法通过qRT-PCR法检测肝癌及其癌旁组织中miR-144的表达，以瞬时转染建立人肝癌细胞过表达miR-144模型，采用CCK-8和细胞克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的增殖和细胞克隆形成能力，采用流式细胞术、Transwell法检测肝癌细胞的细胞周期和迁移能力，分析miR-144的表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响及其与临床病理特征的关系。结果miR-144在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织（P＜0.05）；与未处理及阴性对照的肝癌细胞相比，过表达的miR-144均能有效抑制肝癌细胞的增殖、细胞克隆形成及迁移能力（P均＜0.05），并诱导细胞周期阻滞在S期（P＜0.05）；miR-144高表达组的肝癌患者术后生存时间长于低表达组（P＜0.05），miR-144的表达与患者性别、年龄、乙肝病毒感染、肿瘤大小、肿瘤个数、AFP、临床分期等临床病理特征无明显相关（P均＞0.05）。结论miR-144在肝癌组织中低表达且与预后相关，过表达的miR-144能够抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

肝肿瘤；miR-144；增殖；迁移；预后

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是全球第五大恶性肿瘤，在癌症死因中位居第三位［1］。肝癌的发生是一个复杂的多步骤渐进过程，涉及很多信号因子的改变，从而构成一个纷繁复杂的分子谱［2，3］。目前对肝癌的发病机制仍不明了。microRNAs（简称miRNAs）是一类长约22个碱基的内源性非编码RNA，通过靶向mRNA的3′非编码区域（3′untranslated region，3′UTR）来降解靶基因的mRNA或抑制其翻译，作为多靶基因的转录后负调控作用。研究证实miRNAs可作为癌基因或抑癌基因广泛参与多种肿瘤（包括肝癌）的生物学过程，如细胞增殖、凋亡和转移等［4～7］。因此，对异常表达miRNAs的研究将有助于揭示肝癌发生、发展的机制，以及探寻肝癌新的治疗靶点。

研究发现，miR-144在多种肿瘤中的表达下调，并参与肿瘤细胞的多个生物学过程，如在甲状腺癌中，miR-144的表达下调促进了癌细胞的侵袭［8］；miR-144通过靶向EZH2和调控Wnt信号传导通路抑制膀胱癌细胞的增殖［9］；恢复miR-144的表达则抑制非小细胞肺癌细胞的增殖及诱导其凋亡［10］。我们前期进行的高通量大规模测序研究发现miR-144在肝癌组织中低表达［11］，本研究旨在进一步验证miR-144在肝癌细胞及组织中的表达水平，分析miR-144的表达与临床病理、预后的关系，并探讨其在肝癌细胞中的生物学功能及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料及组织标本组织标本源于2011年 3月至2013年5月在广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科行手术根治性切除的51例肝癌患者，其中男性44例，女性7例，平均年龄46岁。收集每例患者术后的肝癌组织及其癌旁组织，迅速置于液氮中保存。术前所有患者未经化疗、放疗及靶向治疗，术后病理检查均诊断为肝癌。对所有患者进行随访，中位随访时间为12个月。本研究征得每位患者的知情同意，且经本院医学伦理委员会批准。

1.1.2 细胞系人肝癌细胞系QGY-7703、SK-hep1及正常肝细胞HL-7702均源于上海生命科学院细胞库，由本实验室传代、保存。

1.1.3 主要试剂和仪器RPMI 1640（Gibco）、胎牛血清（F月S，Gibco）、TRIzol（Invitrogen）均购自美国Life公司；CCK-8购自日本同仁化学公司；miR-144模拟物及阴性对照（NC）模拟物由上海吉玛生物公司合成；所有引物由上海英骏生物公司合成；miRNA逆转录试剂盒ReverTra Ace-α-及荧光定量PCR试剂盒Thunderbird Sybr qPCRMix购自日本Toyobo公司；转染试剂Interferin购自法国Polyplus-transfection公司；细胞周期试剂盒购自凯基公司；Transwell小室购自美国Corning公司。荧光定量PCR仪MxPro-Mx3000P Sequence Detection System购自美国Stratagene公司；流式细胞术仪购自美国月eckman Coulter公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染人肝癌细胞系QGY-7703、SK-hep1在含10%胎牛血清的RPMI 1640中置于37℃、5%CO2的培养箱培养。细胞铺板、培养过夜后，用转染试剂Interferin将miR-144及NC模拟物转入肝癌细胞系QGY-7703、SK-hep1中，模拟物终浓度为100μmol/L。

1.2.2 细胞、组织逆转录及荧光定量PCR（qRT-PCR）

总RNA用TRIzol试剂进行抽提。采用第一链cDNA逆转录试剂盒ReverTra Ace-α-进行miRNA逆转录，用Thunderbird Sybr qPCR Mix试剂盒进行荧光定量qRT-PCR反应，以上实验均按试剂盒说明书操作。miR-144特异性逆转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTACA-3′；miR-144 qRT-PCR引物为5′-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件为95℃预变性1 min，之后95℃15 s，58℃15 s，72℃45 s，40个循环后检测溶解曲线。反应结束后用MxPro Mx3000PSequence检测系统进行分析。

1.2.3 细胞增殖、细胞克隆形成实验将肝癌细胞以5×103个/孔接种于96孔板中培养过夜，更换培养基后转染miR-144及NC模拟物，每组设5个复孔，于0 h、24 h、48 h、72 h后分别加入10μl CCK-8，在细胞培养箱孵育2 h后，用酶标仪检测吸光度，根据吸光度值绘制肝癌细胞增殖曲线。将肝癌细胞以1×103个/孔接种于6孔板中培养过夜，更换培养基后转染miR-144及NC模拟物，每组设3个复孔，培养10 d后，用4%的多聚甲醛固定30min，然后用1%的结晶紫染色，拍照并计数细胞克隆形成数（50个细胞/克隆）。

1.2.4 细胞周期实验转染miR-144及NC模拟物48 h后收集细胞，用预冷的P月S洗涤1次，用70%的乙醇于4℃固定过夜，离心去除乙醇后，用P月S洗涤2次，加100μl RNase A 37℃水浴30 min，再加入400μl PI染色，4℃避光30 min，最后用流式细胞术检测细胞周期。重复实验3次。

1.2.5 细胞迁移实验细胞转染24 h后计数，将5×104个细胞重悬于200μl无血清培养基中，并置于Transwell上室中，下室加入600μl含10%F月S的RPMI 1640培养基。在细胞培养箱中孵育24 h，取出上室后用棉签轻轻擦去上室内部细胞，固定、染色，风干后置于倒置显微镜下拍照、计数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件分析、处理实验数据。计量资料用均数±标准差（±s）表示，样本间miR-144的表达分析采用配对t检验；miR-144的表达与临床病理特征关系采用χ2检验及Fisher确切概率法；术后生存期采用Kaplan-Meier法及log-rank检验分析；多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-144在肝癌组织中的表达

为了验证本课题组前期的高通量大规模测序结果，本研究通过qRT-PCR方法检测51例肝癌患者的癌组织及其癌旁组织miR-144的表达水平。结果显示，92.16%（47/51）的肝癌组织中miR-144呈低表达，miR-144在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.05）（图1A）。此外，根据miR-144在肝癌组织中表达量的中位数，将51例肝癌患者分成两组，分别为高表达组26例，低表达组25例。分析发现，miR-144的低表达与肝癌患者更短的术后生存时间显著相关（P＜0.05）（图1月）。miR-144的表达量与患者性别、年龄、乙肝病毒感染、肿瘤大小、肿瘤个数、AFP、临床分期等临床病理特征无明显相关（P均＞0.05）。见表1。为了验证miR-144的转染效率，我们对转染模拟物后的miR-144组、NC组及未处理组进行qRT-PCR验证。结果显示，QGY-7703和SK-hep1的miR-144表达水平高于其他两组。见图1C。

2.2 miR-144对肝癌细胞增殖和细胞克隆形成的影响

CCK-8法检测转染miR-144及NC模拟物后肝癌细胞的增殖能力。结果显示，在转染48 h后，与NC组及未处理组相比较，miR-144组QGY-7703及SK-hep1细胞的增殖能力明显受抑制（P＜0.05）；转染72 h后，对肝癌细胞的抑制作用最为明显（P＜0.05）（图2A）。细胞克隆形成能力检测结果如图2月所示，在转染10 d后，QGY-7703及SK-hep1细胞的miR-144组细胞克隆团数明显少于NC组及未处理组（P＜0.05）。

2.3 miR-144对肝癌细胞细胞周期的影响

为了验证过表达的miR-144是否通过抑制细胞周期影响肝癌细胞的增殖，通过流式细胞术检测转染miR-144模拟物48 h后的肝癌细胞细胞周期。结果显示，与NC组及未处理组相比较，miR-144组肝癌细胞的S期明显增多，miR-144组、NC组及未处理组S期的细胞百分比在QGY-7703细胞中分别为（26.95±0.66）%、（19.02±0.1）%、（22.11±0.54）%（P＜0.05）；SK-hep1肝癌细胞分别为（25.52±0.08）%、（21.02±2.26）%、（20.66±0.19）%（P＜0.05）。说明过表达miR-144可以使肝癌细胞细胞周期阻滞在S期，从而抑制肝癌细胞的增殖。见图3。

2.4 miR-144对肝癌细胞迁移的影响

miR-144模拟物转染肝癌细胞48 h后，Transwell实验结果显示，QGY-7703及SK-hep1细胞miR-144组的细胞穿膜数均明显少于NC组及未处理组（P＜0.05）。说明过表达的miR-144可以抑制肝癌细胞的迁移能力。见图4。

图1 m iR-144在肝癌组织中的表达及其与预后的相关性和转染后的qRT-PCR验证

图2 转染m iR-144对肝癌细胞增殖及细胞克隆形成的影响

图3 转染m iR-144模拟物对肝癌细胞细胞周期的影响

表1 m iR-144的表达与肝癌患者临床病理特征的关系［n（%）］

图4 转染m iR-144模拟物对肝癌细胞迁移能力的影响

3 讨论

近年研究表明，miRNAs不仅参与人体正常的生理过程，而且其异常表达在肿瘤发生、发展、诊断和预后中扮演非常重要的角色，几乎参与肿瘤所有的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成等。因此，miRNAs受到学者们越来越多的关注，被视为一种潜在的肿瘤诊断和治疗工具［12］。本研究中，miR-144在肝癌组织中普遍低表达，而且与患者预后相关，提示其有可能作为一个潜在的生存指标。同时体外实验发现，miR-144具有抑癌因子的生物学功能，可以抑制肝癌细胞的生长和迁移。

miR-144在多种肿瘤中低表达，并发挥抑癌基因的作用。Navon等［13］使用新的基于秩和统计学方法，分析来源于8种不同组织（乳腺、结肠、肝、肺、淋巴、卵巢、前列腺、睾丸）的癌及其癌旁组织32个miRNAs芯片（miRNAs数量超过700个），结果发现一些miRNAs在多数肿瘤中的表达趋势一致，其中miR-144在这8种肿瘤中普遍低表达，提示其可能具有抑癌功能。Guan等［8］研究miR-144在甲状腺癌中的作用，发现过表达的miR-144可以靶向ZE月1和ZE月2抑制甲状腺癌细胞的侵袭。Zhang等［14］发现PAX4可以下调miR-144/451，miR-144/451下调后失去对解聚素金属蛋白酶（ADAM）家族ADAMTS5和ADAM10的抑制作用，进而促进乳腺癌及头颈鳞状细胞癌的转移。其他研究则证实miR-144可以直接靶向X染色体锌指蛋白（ZFX），不仅可以抑制非小细胞肺癌细胞的生长，诱导其凋亡［10］，还可以提高胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性［15］。但也有研究发现miR-144在其他癌组织中呈高表达，并且具有促癌基因的作用［16］，这可能与miRNAs的组织特异性相关。本研究发现，miR-144在肝癌组织中普遍低表达，恢复miR-144的表达后能明显抑制肝癌细胞的增殖、细胞克隆形成及迁移能力，这与之前的报道一致［17，18］。本实验还发现，miR-144能够阻滞肝癌细胞周期于S期，这与王铮等［18］的研究不同，他们认为miR-144对细胞周期无明显影响，其原因可能与转染载体或实验条件有关。

miRNAs不仅可参与肿瘤的发生、发展，而且还可以作为一种潜在的分子标志物应用于临床，如在肺癌［19］、胃癌［20］、肝癌［21］和白血病［22］中的研究表明，特异性差异表达的miRNAs与肿瘤患者的临床病理及预后相关。据文献报道，miR-144在胃癌［15］、结直肠癌［23］、头颈鳞状细胞癌［14］中呈低表达，低表达的miR-144提示患者预后较差，同时低表达的miR-144在结直肠癌患者中提示有更多的血管侵犯、肝转移和更高的术后复发率［23］。本实验分析51例肝癌患者临床病理及术后生存时间与miR-144表达水平的关系，发现肝癌组织miR-144的高低表达在肿瘤大小、肿瘤个数、AFP、临床分期等临床病理中无显著差异，而miR-144的表达水平则与患者术后生存期明显相关（P＜0.05），miR-144低表达者其预后较差。

虽然miR-144作为一种抑癌基因在多种肿瘤中呈低表达，但至今其机制仍不清楚。miR-144（Gene ID：406936）与miR-451（Gene ID：574411）均定位于人类染色体17q11.2，miR-144位于miR-451上游100 bp处，作为同一个基因簇，miR-144/451在某些疾病的表达和调控方面具有一致性［14，24，25］。研究发现，miR-451在肝癌组织中低表达，恢复其表达后可以靶向IKK-β抑制肝癌细胞的增殖［26］，或者调控转录激活因子2（ATF2）抑制肝癌细胞迁移［27］。这些证据说明，miR-144/451在某些组织中下调的机制可能相同。其中一种可能的机制是表观遗传。Wang等［28］试图探讨miR-451在非小细胞肺癌细胞中下调是否与DNA甲基化和（或）组蛋白脱乙酰化相关，当用5-氮-2′-脱氧胞苷、苯丁酸钠及两者联合处理非小细胞肺癌细胞后，发现miR-451的表达分别提高2.5倍、4.2倍和6.4倍，说明表观遗传可能直接或间接参与了miR-451的下调；而Li等［26］的研究发现，内源性抑癌基因E2a可以通过靶向E盒转录激活miR-451的启动子，提示抑癌基因对miR-144/451上游的调控也许是另外一种机制；基因组中miR-144/451所在位点的缺失或突变是否为其异常表达的原因，目前尚未见相关报道。因此有关方面仍需进一步研究。

综上，miR-144在肝癌组织中低表达与患者预后相关，过表达miR-144能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移。但由于miRNAs能够调控多个靶点发挥作用，因此有关miR-144下调及其调控的机制，亟待更深入地研究。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［2］Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN.Molecularmechanisms of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，48（6）：2047-2063.

［3］Aravalli RN，Cressman EN，Steer CJ.Cellular and molecularmechanisms of hepatocellular carcinoma：an update［J］.Arch Toxicol，2013，87（2）：227-247.

［4］Kong YW，Ferland-McCollough D，Jackson TJ，et al.microRNAs in cancermanagement［J］.LancetOncol，2012，13（6）：e249-258.

［5］Zhou X，Zhang CZ，Lu SX，et al.miR-625 suppresses tumourmigration and invasion by targeting IGF2BP1 in hepatocellular carcinoma［J］. Oncogene，2015，34（8）：965-977.

［6］Hou J，Lin L，Zhou W，et al.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma revealsmiR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2011，19（2）：232-243.

［7］孙阳阳，丁骏，周晓丽，等.miR-21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响［J］.中国癌症防治杂志，2013，5（1）：6-11.

［8］Guan H，LiangW，Xie Z，etal.Down-regulation ofmiR-144 promotes thyroid cancer cell invasion by targeting ZEB1 and ZEB2［J］.Endocrine，2015，48（2）：566-574.

［9］Guo Y，Ying L，Tian Y，et al.miR-144 downregulation increases bladder cancer cell proliferation by targeting EZH2 and regulating Wnt signaling［J］.FEBS J，2013，280（18）：4531-4538.

［10］Zha W，Cao L，Shen Y，et al.Roles of Mir-144-ZFX pathway in growth regulation of non-small-cell lung cancer［J］.PLoSOne，2013，8（9）：e74175.

［11］Huang XP，Hou J，Shen XY，et al.MicroRNA-486-5p，which is downregulated in hepatocellular carcinoma，suppresses tumor growth by targeting PIK3R1［J］.FEBS J，2015，282（3）：579-594.

［12］Zhu Z，Zhang X，Wang G，et al.Role ofmicroRNAs in hepatocellular carcinoma［J］.HepatMon，2014，14（8）：e18672.

［13］Navon R，Wang H，Steinfeld I，et al.Novel rank-based statistical methods reveal microRNAs with differential expression in multiple cancer types［J］.PLoSOne，2009，4（11）：e8003.

［14］Zhang J，Qin X，Sun Q，et al.Transcriptional control of PAX4-regulated miR-144/451 modulatesmetastasis by suppressing ADAMs expression［J］.Oncogene，2014.

［15］Akiyoshi S，Fukagawa T，Ueo H，et al.Clinical significance of miR-144-ZFX axis in disseminated tumour cells in bonemarrow in gastric cancer cases［J］.Br JCancer，2012，107（8）：1345-1353.

［16］Zhang LY，Ho-Fun Lee V，Wong AM，et al.MicroRNA-144 promotes cell proliferation，migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma through repression of PTEN［J］.Carcinogenesis，2013，34（2）：454-463.

［17］Cao T，Li H，Hu Y，et al.miR-144 suppresses the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting E2F3［J］.Tumour Biol，2014，35（11）：10759-10764.

［18］王铮，张明鑫，张灵敏，等.miR-144表达质粒的构建及其对肝癌细胞生物学行为的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2011，39（10）：17-22，27.

［19］Jiang C，Hu X，Alattar M，etal.miRNA expression profiles associated with diagnosis and prognosis in lung cancer［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2014，14（4）：453-461.

［20］Song J，Bai Z，Zhang Z.MicroRNAs are implicated in the initiation and progression of gastric cancer［J］.Chin Med J，2014，127（3）：554-559.

［21］Giordano S，Columbano A.MicroRNAs：new tools for diagnosis，prognosis，and therapy in hepatocellular carcinoma?［J］.Hepatology，2013，57（2）：840-847.

［22］Babashah S，Sadeghizadeh M，TaviraniMR，et al.AberrantmicroRNA expression and its implications in the pathogenesis of leukemias［J］. Cell Oncol，2012，35（5）：317-334.

［23］Iwaya T，Yokobori T，Nishida N，et al.Downregulation ofmiR-144 is associated with colorectal cancer progression via activation ofmTOR signaling pathway［J］.Carcinogenesis，2012，33（12）：2391-2397.

［25］Liu L，Wang S，Chen R，et al.Myc induced miR-144/451 contributes to the acquired imatinib resistance in chronicmyelogenous leukemia cell K562［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425（2）：368-373.

［26］Li HP，Zeng XC，Zhang B，et al.miR-451 inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma through direct suppression of IKK-β［J］.Carcinogenesis，2013，34（11）：2443-2451.

［27］Lv G，Hu Z，Tie Y，et al.MicroRNA-451 regulates activating transcription factor 2 expression and inhibits liver cancer cellmigration［J］. Oncol Rep，2014，32（3）：1021-1028.

［28］Wang R，Wang ZX，Yang JS，et al.MicroRNA-451 functions as a tumor suppressor in human non-small cell lung cancer by targeting rasrelated protein 14（RAB14）［J］.Oncogene，2011，3（23）：2644-2658.

［2015-02-01收稿］［2015-03-20修回］［编辑阮萃才］

Exp ression and clinical significance of m iR-144 and its im pact of biological function in hepatocellu lar carcinom a

HUANG Chaoyuan1，2，HUANG Xinping1，LI Xianjian1，ZHU Jiye1，CHEN Zhigang1，HUANG Shan1，ZHAO Yinnong1，LIAN Fang3，WU Guobin1（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University；3Department of Pathophysiology，GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

WU Guobin.E-mail：gb.wu@139.com

Liver neoplasm；miR-144；Proliferation；Migration；Prognosis

R735.7

A

1674-5671（2015）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.02

国家自然科学基金资助项目（81360315）；广西卫生厅自筹经费科研课题（Z2011228）

邬国斌。E-mail：gb.wu@139.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression ofmiR-144 in hepatocellular carcinoma（HCC）tissue and its relationship with clinicopathological factors，aswell as its function in cells.M ethodsExpression ofmiR-144 in HCC and adjacent noncancerous tissue from patientswas quantitated using qRT-PCR，and levelswere compared with clinicopathological factors to identify possible correlations. Mimics ofmiR-144 and a negative control（NC）sequencewere transfected into human HCC cell lines，which were analyzed in terms of proliferation（CCK-8 assay），colony formation and migration（transwell assay）as well as cell cycle（flow cytometry）.ResultsExpression ofmiR-144 was significantly lower in HCC samples than inmatched controls（P＜0.05）.Overexpression ofmiR-144 in HCC cell lines，but not the non-treated or the NC sequence，significantly reduced proliferation，colony formation and migration（P＜0.05），as well as arrested the cell cycle in S phase.Postoperative survival was longer in HCC patients showing high miR-144 expression than in those showing low expression（P＜0.05）.Other clinicopathological factors，however，did not correlate with miR-144 expression，including tumor size or number，AFP（P＞0.05）.ConclusionFrequently downregulated in HCC tissues，miR-144 acts as a tumor suppressor and may serve as a prognostic factor.