核桃JrsHSP17．3基因克隆及温度胁迫响应模式分析

杨桂燕，贾彩霞，孙宇栋，李 鸣，翟梅枝

（西北农林科技大学 林学院 核桃研究中心，陕西杨陵712100）

热激蛋白（HSP）是一类受温度刺激诱导表达的蛋白质。自1962年在黑腹果蝇体内发现HSP蛋白以来［1］，在其他各类生物群包括植物也相继发现了HSP的存在［2］。例如，红藻（Cyanidioschyzon merolae）的2个HSP 蛋白能同时迅速响应热胁迫，且与对照比较其表达大于1 000 倍［3］。摇蚊（Chi－ronomusriparius）HSP27基因在35 ℃能被明显诱导，但在低温胁迫下其表达不明显，4 ℃时该基因的转录水平明显下降，但进入正常生长温度时，其转录水平能迅速恢复并显著过表达，表明该基因对环境刺激因素具有敏锐性［4］。在2 ℃胁迫下，胡萝卜（Daucus carota）DcHSP17．7 在 营 养 组 织 中 被 诱导，且该基因作为分子伴侣阻止低温胁迫导致的蛋白降解，进而有利于植株的抗寒［5］。

根据分子量大小可以将植物HSP 分为小HSPs（sHSPs）、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100等5类［6］。其中sHSPs是分子量分布在15kD～42 kD 的一类HSP 蛋白［7］，包含具有进化分歧的N－端、后接一个保守的约由90个氨基酸残基组成的ɑcrystallin结构域（ACD）以及一个较短的C－端［8－9］。sHSPs的主要功能涉及植株的生长、防御、非生物胁迫响应等多个方面［10］。例如，从麻风树（Jatropha curcas）发 育 种 子 中 克 隆 获 得 的JcHSP－1 和JcHSP－2基因，在植物细胞保护和种子成熟发育中起重要作用［11］；过表达拟南芥HSP23基因能增强植株的耐盐能力［12］；柽柳sHSP 基因能响应NaCl、高温、低温等不同胁迫诱导［13］，且ThHSP18．3 能改善转基因酵母的多重抗逆能力［14］。

核桃（Juglans regia）属多年生落叶果木，是中国经济林中分布广泛的树种之一，资源丰富。由于全球气候变化，核桃的生长发育、结实坐果等多方面也受到不同程度的影响。特别是中国西北部，频繁的倒春寒现象严重制约了核桃的产量和经济效益。因此研究核桃的温度胁迫响应功能及机理将为预防或调节核桃遭受倒春寒、冷冻害等胁迫提供一定的理论依据。本研究从核桃中克隆获得JrsHSP17．3基因，分析了核桃JrsHSP17．3基因在不同温度胁迫下的组织表达模式，以及它对高温和低温胁迫的响应特征，为研究核桃抗寒耐高温相关基因的功能及抗逆机理打下基础。

1 材料和方法

1．1 植物材料处理

核桃品种‘香玲’种子采自西北农林科技大学核桃研究中心核桃采穗圃。将种子播种于泥炭土∶珍珠岩＝2∶1（V／V）的混合土壤中，培养条件为温度（22±2）℃，光照14h／黑暗10h，相对湿度70%～75%。于温室大棚中培育2个月，使用光照培养箱进行温度处理。温度处理分别设36、40、44、48、52℃等高温，16、12、10、8和6 ℃等低温，处理时间分别为1 和2h。正常生长条件下的植株未进行处理（0h）设为对照。每个处理设置3次重复。

1．2 方法

1．2．1 JrsHSP17．3 基 因 克 隆 与 序 列 分 析 以“heat shock protein”为关键词在‘香玲’核桃叶片转录组中查找相关基因，结果共获得10 余条sHSP基因。经Blast比对，根据注释结果发现1 条为sHSP17．3 基因，命名为JrsHSP17．3。用ORF finder确定JrsHSP17．3基因开放读码框（ORF），再根据ORF两端序列设计引物JrsHSP17．3－YZ－F（5′－ATGGATCTCAGAATCATGGGT－3′）和JrsHSP17．3－YZ－R（5′－TTATGCAATCTTAACCTCAATT－3′），进行PCR 扩增。扩增产物胶回收纯化后，与pMD－18－T 载体16 ℃下连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，并在氨苄青霉素存在下筛选培养。挑取阳性克隆扩大培养进行菌液PCR 确认，对能够产生目的片段的克隆进行测序。利用Expasy ProtParam（http：／／web．expasy．org／protparam／）对 确 认 的JrsHSP17．3 基 因 进 行 分析；利 用BLASTP（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast）进行序列同源搜索；利用Clustal 3．0 和MEGA 软件对不同物种的sHSP17蛋白进行进化分析。

1．2．2 JrsHSP17．3 基 因 组 织 表 达 分 析 使 用CTAB法［15］提取各样品总RNA，经DNA 酶消化后用PrimeScriptTMRT reagent Kit（CWBIO，北京，中国）进行反转录。将获得的cDNA 稀释10 倍后作为实时荧光定量PCR（qRT－PCR）模板。qRT－PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）进 行，qRT－PCR 引 物 为JrsHSP17．3－F（5′－ATGGATCTCAGAATCATG－3′）和JrsHSP17．3－R（5′－CTACCTGGACCTTGATGTC－3′）。选 取 核桃18SrRNA（HE574850）基因［16］作为内参基因，内参 基 因 引 物 为18S－rRNA－F（5′－GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT－3′）和18S－rRNA－R（5′－TCGCATTTCGCTACGTTCTT－3′）。反 应 程 序 为：94℃预变性30s；94 ℃变性12s，60 ℃退火45s，72℃延伸45s，45个循环；81 ℃读板1s，每个样品重复3次。采用2－△△Ct法对定量结果进行分析［17］。

2 结果与分析

2．1 JrsHSP17．3 基因全长cDNA 的获得及序列分析

通过分析核桃转录组发现其中存在10 余条sHSP 蛋 白，经Blast 分 析 发 现 其 中1 条 为sHSP17．3（命名为JrsHSP17．3），根据序列设计起始和末端引物（JrsHSP17．3－YZ－F／R）进行PCR 验证，确认其ORF长474bp，编码的蛋白含157个氨基酸，分子量为17．64kD，理论等电点为5．35（图1）。Blast分析发现该基因具有ɑ－crystallin（ACD）保守域，表明该蛋白为sHSP蛋白。

利用Blastp搜索同源蛋白进行比对分析，发现来自不同植物的sHSP17 蛋白相似性较高，大于70%，JrsHSP17．3 与 葡 萄VvsHSP17．3 和 毛 果 杨PtsHSP17．7同源关系较近（图2）。

2．2 高温胁迫下JrsHSP17．3的表达

图1 核桃JrsHSP17．3基因ORF全长及推导的氨基酸Fig．1 The full length of JrsHSP17．3ORF and deduced amino acid sequence

提取不同高温处理下核桃根、茎、叶总RNA，反转录为cDNA 后进行qRT－PCR 分析。结果显示，高温胁迫下JrsHSP17．3 基因在根、茎、叶中均有不同程度表达，且主要表现为上调表达（图3）。在4 4℃环境胁迫1h，JrsHSP17．3在根中的表达量最大，为对照的107．63 倍；在36 ℃时的表达被抑制，为对照的11．03%，52 ℃时为对照的4．50 倍。JrsHSP17．3基因在茎中的变化趋势与根中相似，36℃时被抑制表达，表达量仅为对照的34．87%，44℃时最高，为对照的54．95倍；叶中的表达趋势与根茎中的表达差异较大，36 ℃为上调表达，而40 ℃时被抑制，为对照的30．99%，48 ℃时被诱导最明显，为对照的77．71倍（图3，A）。

图2 核桃JrsHSP17．3蛋白的进化树分析进化树中蛋白名称后括号内为蛋白GenBank登录号；分支上数值表示1 000次重复抽样符合聚类的百分数。PtsHSP17．7．毛果杨；VvsHSP17．3．葡萄；CpsHSP17．7．番木瓜；MdsHSP17．3．苹果；JcsHSP17．5．麻风树；RcsHSP17．5．蔷薇杂交品种；TcsHSP17．6．可可；VfsHSP17．9．蚕豆；MssHSP17．6．苜蓿；SlsHSP17．6．番茄；NtsHSP17．3．烟草Fig．2 The phyogenetic tree analysis of JrsHSP17．3protein The symbol behind the protein in the brackets were GeneBank numbers．The numbers on the branches mean the percentages of times the species are grouped together in the bootstrap analysis for 1 000replicates．PtsHSP17．7．Populus trichocarpa；VvsHSP17．3．Vitis vinifera；CpsHSP17．7．Carica papaya；MdsHSP17．3．Malus domestica；JcsHSP17．5．Jatropha curcas；RcsHSP17．5．Rosa hybrid cultivar；TcsHSP17．6．Theobroma cacao；VfsHSP17．9．Vicia faba；MssHSP17．6．Medicago sativa；SlsHSP17．6．Solanum lycopersicum；NtsHSP17．3．Nicotiana tomentosiformis

图3 高温胁迫1h（A）和2h（B）核桃JrsHSP17．3基因的表达Fig．3 Expression of JrHSP17．3exposed to high temperatures for 1h（A）and 2h（B）

图4 低温胁迫1h（A）和2h（B）核桃JrsHSP17．3基因的表达Fig．4 Expression of JrHSP17．3exposed to low temperatures for 1h（A）and 2h（B）

2h胁迫下，根的变化略区别于茎和叶，根中JrsHSP17．3的转录水平在48 ℃时达最大值，为对照的25．46倍；52 ℃略低，为对照的13．45倍。茎和叶中的表达均在52 ℃最大，分别为对照的41．07和104．69倍（图3，B）。

2．3 低温胁迫下JrsHSP17．3的表达

低温胁迫后，JrsHSP17．3 基因在不同组织和不同时间表现出差异，但主要表现为上调表达。胁迫1h，根在10 ℃被抑制，为对照的33．68%，其他低温处理下被上调为对照的6．28～79．89倍；茎中均为诱导表达，12℃最高，为对照的142．02倍，6℃也被诱导较高水平，为对照63．12倍，10 ℃最低，为对照的2．39倍；叶中也均为上调表达，在12 ℃最高，为对照的93．70倍，6 ℃最低，仅为对照的1．67倍（图4，A）。胁迫2h，根中的表达均为上调表达，相对于对照的表达，被上调了2．97～55．33倍；茎中的表达量相对小，如在10 ℃胁迫下最高，表达为对照的25．46倍，在16 ℃被抑制；叶中的表达比根和茎都不明显，在8 ℃、6 ℃为抑制表达，12 ℃最高，也只有对照的13．45倍（图4，B）。

3 讨 论

通过分析‘香玲’核桃转录组和PCR 验证获得

JrsHSP17．3基因，它含有sHSP蛋白ACD保守域，属于sHSPs成员；BlastP分析发现JrsHSP17．3属于sHSP17．3类蛋白，在进化关系上与毛果杨PtsHSP17．7蛋白、葡萄VvsHSP17．3蛋白、苹果MdsHSP17．3蛋白、木瓜CpsHSP17．7蛋白较近，而与蚕豆VfsHSP17．9蛋白、蔷薇杂交品种RcsHSP17．5 蛋白、烟草NtsHSP17．3蛋白、番茄SlsHSP17．6蛋白较远，表明JrsHSP17．3蛋白在功能特性上可能与毛果杨、葡萄、苹果、木瓜等的sHSP17蛋白相似。

有研究表明sHSPs蛋白是植株响应温度变化、进行温度胁迫保护调节的重要分子伴侣，也是调控其他非生物胁迫响应的重要因子［12，18］。对拟南芥、水稻等模式植物中有关HSP 基因的研究较多［19］，木本植物中的研究相对较少。Yang等［13］研究柽柳（Tamarix hispida）9个sHSP 基因的表达模式发现，这些sHSP 基因在温度胁迫下主要表现为上调表达，推测其为柽柳响应温度胁迫调控的重要因子。核桃是中国重要的经济树种，具有重要的经济价值，分布广泛，深受广大人们喜爱，保证核桃的经济效益尤为重要。目前，随着全球气候变化，核桃的生产受到一定的限制，核桃的抗逆机制特别是抗寒耐高温调控机理相关研究亟待进行。

本研究对核桃JrsHSP17．3 基因在不同温度胁迫不同时间时不同组织中的表达水平进行分析，结果发现，相同温度相同时间处理下，根、茎、叶中的表达差异较大。如36 ℃胁迫1h根中的表达分别为茎和叶的31．64%和6．56%；8 ℃胁迫1h，茎中的表达分别为根和叶的3．20倍和7．26倍。相同组织不同温度处理相同时间下的表达也具有差异，如，根在36 ℃～52 ℃处理2h 时其表达值为对照的0．35～25．46倍，6 ℃～16 ℃胁迫2h时为对照的2．97～55．33倍。同一组织在同一温度胁迫不同时间下的表达也有较大差异，如44 ℃胁迫1h根中的表达是2h时的11．18倍，4 ℃胁迫1h叶中的表达是2h的18．90倍。表明JrsHSP17．3基因响应温度胁迫具有组织表达特异性和时序表达特异性，体现了sHSP 的表达与胁迫温度和时间的关系，与C．Howarth等［20］的结论一致。不同植物HSP蛋白的表达具有差异，如柽柳在4 ℃胁迫2h 时9 个sHSP 基因的表 达 差 异 较 大［13］，JrsHSP17．3基 因在胁迫1h后表现为明显的上调表达，而有些植物的sHSP 基因则在胁迫15 min 后即可被显著诱导 。表明来自不同植物的同一家族基因的表达，受相同温度诱导的响应时间具有差异性，由此可推知，相同基因在不同植物中，对相同胁迫的调控方式及调节能力可能有一定的差异性。本研究较系统地分析了核桃JrsHSP17．3 基因在不同温度不同时间胁迫下的表达水平，表明JrsHSP17．3基因与温度胁迫调控具有一定的关系，为继续研究sHSP 逆境应答功能、核桃抗逆机理打下了基础。

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