葱兰大小孢子发生和雌雄配子体发育及其系统学意义

王璐赟，卢 梅，陈春燕，敖成齐

（温州大学 生命与环境科学学院，浙江温州325035）

葱兰（Zephyranthes candida）为石蒜科葱兰属的多年生草本植物。原产南美洲及西印度群岛，在中国江南、黄淮地区均广泛栽培，具有易管理、繁殖力强等优点，因此在园林绿化方面得到较广泛的应用。葱兰全草含多种生物碱，包括石蒜碱、多花水仙碱、尼润碱等，能平肝熄风，具有一定的药用价值。

石蒜科的系统学长期存在争议。例如，德国植物学家Englar曾根据子房下位这个特征把石蒜科从百合科中分离出来［1］；而Cronquist根据植物体外部形态的相似性，包括是否具有地下茎，叶形、花、果实和种子结构的相似性及植物化学方面的资料（是否含有多种生物碱）等角度，认为石蒜科应该放入百合科内，不应单独成立为一个独立的科［2］。胚胎学是一个涉及花药、胚珠和种子发育的研究领域，并能提供50多个性状用来探讨科间或科内关系［3］。国内对石蒜科的胚胎学研究已有过一些报道［4－6］，但这些零星的胚胎学资料对探讨石蒜科及其相关科属的系统关系还是远远不够的。葱兰靠卵形的鳞茎进行营养繁殖。由于葱兰的鳞茎深埋在土里，而早中期的花芽是夹在鳞茎里生长的，这给取样带来一定的困难，所以长期以来葱兰的胚胎学研究一直是空白。为填补这一空白，本研究对葱兰的花药壁形成、大小孢子的发生和雌雄配子体的发生进行了观察，尽可能多地了解这个过程中的一些细节；将对葱兰属的胚胎学资料作全面总结，并与石蒜科、百合科及葱科的胚胎学特征进行比较。这对系统全面了解葱兰属的胚胎学特征以及利用胚胎学资料探讨石蒜科的系统分类都有重要意义。

1 材料和方法

2011年6～9月在温州大学南校区采集不同发育时期的花或花芽，立即用改良的FAA（89 mL 50%酒精，6mL冰醋酸，5mL 福尔马林）固定并保存。葱兰花芽的采集，不像其它植物材料，在看到花苞后才开始采集。它的开花时间在9月份，而花芽的采集应在6月份开始，需要采集植物的地下茎部分，进行解剖才得到幼嫩的花芽。制片时，用广西岑溪市松香厂研制的T0型生物制片透明剂代替二甲苯进行透明，常规石蜡包埋，依不同花期切片厚度为6～11μm；铁矾－苏木精染色，固绿或番红复染，用附带Olympus－DP71型数码照相机的Olympus－BX51型光学显微镜观察、照相。

2 观察结果

葱兰为多年生常绿草本植物，株高为15～20 cm，叶基生，暗绿色，直立或稍倾斜，茎直立，具鳞茎。花期一般为6～9 月，花茎从叶基部的一侧抽出，花梗中空，顶生一白花。花3基数，包括6个花被片，排成2轮；6个雄蕊，排成2轮，以及1枚3心皮雌蕊。从花的横切片中可见，6个雄蕊不等长：外轮雄蕊较短，横切片中显示花药和花丝，内轮雄蕊较长，横切片中只显示花丝。花药4 室，蝶形花粉囊（图版Ⅰ，26）。

2．1 花药壁的发育

早期花蕾中，在花药表皮下的孢原细胞（图版Ⅰ，1）进行一次平周分裂后，形成外层的初生壁细胞和内层的造孢细胞，之后初生壁细胞再进行一次平周分裂形成内外两层次生壁细胞，此时，花药壁由3层细胞组成（图版Ⅰ，2）。内层的次生壁细胞进一步分化为中层和绒毡层（图版Ⅰ，2），而外层的次生壁细胞则直接发育为药室内壁。药室内壁（1层）、中层（1层）、绒毡层（1层）连同其外面的表皮共4层细胞组成完整的花药壁（图版Ⅰ，3）。中层和绒毡层有共同的起源，根据Davis（1966）的划分，花药壁的发育类型符合单子叶型［7］。

小孢子母细胞减数分裂开始时，花药壁的中层便开始退化。到单核花粉时期，中层完全退化，花药壁仅剩3层（图版Ⅰ，4）。在花药壁的发育过程中，绒毡层细胞在原位解体，其核与质不进入药室中。从绒毡层解体过程来看，葱兰的绒毡层为分泌型绒毡层（图版Ⅰ，4）。

在花粉粒时期，药室内壁开始径向加长，并出现纤维状加厚，表皮完整（图版Ⅰ，5）。在花粉成熟时，整个药室内壁纤维状加厚明显，表皮有部分萎缩退化现象，但表皮仍宿存（图版Ⅰ，6）。

2．2 小孢子发生与雄配子体发育

由孢原细胞（图版Ⅰ，1）分裂而来的造孢细胞经多次有丝分裂，并在最后一次有丝分裂后，发育形成小孢子母细胞（图版Ⅰ，3）。小孢子母细胞体积较大，核大，细胞质浓厚，渐渐分泌出胼胝质的细胞壁，并开始进行减数分裂。其减数第一次分裂后产生的两个子核之间形成细胞壁，产生二分体（图版Ⅰ，7），之后再进行第二次减数分裂形成四分体（图版Ⅰ，8、9），所以胞质分裂为连续型。四分体的排列方式主要为四面体型（图版Ⅰ，8），还有左右对称型（图版Ⅰ，9）。小孢子四分体的后期其胼胝质逐渐溶解，最后，小孢子四分体彼此分离。此时的小孢子只有1个核，称为单核花粉粒（图版Ⅰ，10），小孢子长大后进行一次不等的有丝分裂，形成了大、小核即营养核和生殖核（图版Ⅰ，11），随后产生细胞壁，形成大的营养细胞和透镜状的生殖细胞。但很快生殖细胞脱去细胞壁，变成裸细胞，进入营养细胞中。在花粉管生长前，生殖细胞并不分裂成两个精子（精细胞）。所以葱兰成熟花粉为二细胞型（图版Ⅰ，12）。

2．3 大孢子发生与雌配子体发育

葱兰的雌蕊3 心皮合生，子房下位，3 室，中轴胎座，每室有2列倒生胚珠（图版Ⅰ，13、14）。孢原细胞发生于一层珠心表皮下（图版Ⅰ，17），经过一次平周分裂形成1个壁细胞和1个造孢细胞。后者直接充当大孢子母细胞（图版Ⅰ，18）。在大孢子母细胞时期分化出了内外珠被，珠心壁有2层细胞，即除了1层表皮细胞之外，还有1 层壁细胞（图版Ⅰ，18）。所以葱兰的胚珠为厚珠心类型。

胚珠发育初期，在心皮内侧沿中轴胎座上产生一团突起，即胚珠原基（图版Ⅰ，16）；胚珠原基逐渐增大，最后分化为具有珠被、珠心和珠柄的成熟倒生胚珠（图版Ⅰ，15）。整个胚珠扭转成倒钩状。

大孢子母细胞历经两次连续分裂，第一次分裂（图版Ⅰ，19）形成2个细胞，即二分体（图版Ⅰ，20）；第二次分裂形成4个大孢子，呈线型排列，为线型四分体（图版Ⅰ，21）。此后，4个大孢子中靠近珠孔端的3个退化，靠近合点端的1个成为功能大孢子，进一步经过有丝分裂形成2 核胚囊、4 核胚囊（图版Ⅰ，22）和8核胚囊。最后形成的成熟胚囊，由3个反足细胞、2个极核（图版Ⅰ，23）和卵器组成，其中卵器由1个洋梨形卵细胞（图版Ⅰ，25）和2个长茄形助细胞组成。

3 讨 论

3．1 葱兰的胚胎学特征

葱兰花药4室，花药壁由4层结构组成，由外至内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层，其中各部分均由1层细胞组成，其发育类型属于单子叶型，绒毡层属于分泌型；花粉成熟时药室内壁产生明显的纤维状加厚，表皮宿存。小孢子胞质分裂类型为连续型，小孢子四分体排列方式主要为四面体型，少数为左右对称型，成熟花粉为2－细胞型花粉。葱兰的雌蕊3心皮合生，子房下位，中轴胎座，3室，每室具2列倒生胚珠。胚珠双珠被，厚珠心，具蓼型胚囊，胚囊发育过程中可观察到直线型四分体。

3．2 葱兰属胚胎学特征的系统学意义

胚胎学特征在植物系统进化过程中是属于十分保守的性状，因此它是判定不同类群间亲缘关系的重要参考依据之一。关于石蒜科的分类地位前人做过大量的研究工作，观点并不统一：德国植物学家Englar（1964）曾根据子房位置把石蒜科和百合科分开［1］；英国植物学家Hutchinson（1934）则认为从花序的类型角度来区分，比从子房位置的角度更重要，因此他把具有伞形花序和由苞片组成总苞的一些植物，如葱属（Allium）划归为石蒜科内［8］；而Cronquist（1985）根据植物体外部形态的相似性，包括是否具有地下茎，叶形、花、果实和种子结构的相似性及植物化学方面的资料（是否含有多种生物碱）等角度，认为石蒜科应该放入百合科内，不应单独成立为一个独立的科［2］。

基于以上提到的分类学上的这些分歧，本研究总结了葱兰属与石蒜科、百合科、葱科目前已有文献的胚胎学特征（表1）。从表1中可以看出，石蒜科与百合科和葱科的胚胎特征基本相同，其主要差别体现在花药壁发育类型、花药壁中层细胞层数、子房特征、珠心类型和大孢子四分体形态特征这几方面。从石蒜科与百合科在胚胎学特征上的这些差别上来看，本研究不支持Cronquist的观点。作者认为石蒜科和百合科的亲缘关系虽然较近，但它们的胚胎学特征有明显差别。如从花药壁发育类型上来看，石蒜科为双子叶型，而百合科为单子叶型；再如石蒜科的成熟花粉类型为2－细胞型、混合型，而百合科为2－细胞型；还有子房下位与子房上位的区别，也足以显示两个科之间的差别，因此更倾向于支持石蒜科独立成科。而针对Hutchinson将葱科归为石蒜科内的这一划分，本研究通过将葱科与百合科及石蒜科胚胎学特征的比较，发现葱科与石蒜科在胚胎学特征上存在诸多差异，如花药壁发育类型（单子叶型vs双子叶型）、小孢子四分体类型（十字交叉型、四面体型vs十字交叉型）、子房位置（子房上位vs子房下位），但这些特征却与百合科较为相似。因此，本研究不支持Hutchinson的观点，认为应将葱科划归为百合科更合适。

同时，作者发现葱兰属与石蒜科其他属植物的胚胎学特征存在较大的差异：葱兰属花药壁发育类型为单子叶型，成熟花粉为2－细胞型，珠心类型为厚珠心，四分体大孢子为直线型四分体；而石蒜科花药壁发育类型主要为双子叶型，花粉类型主要有2－细胞型和混合型两种类型，珠心类型一般为薄珠心，大孢子四分体常见的为T 型四分体。从比较来看，葱兰属的胚胎学特征反而跟百合科较为相似，但是否可以此作为依据将葱兰属划归于百合科内，还有待于进一步的深入研究。

表1 葱兰属与石蒜科、百合科和葱科胚胎学特征的比较Table 1 Comparison of embryological characters among Zephyranthes，Amaryllidaceae，Liliaceae and Alliaceae

致谢：孙豪、林甲特两位同学参加部分试验工作。

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图版说明：

an．反足细胞；ar．孢原细胞；eg．卵细胞；EN．药室内壁；EP．表皮；gc．生殖细胞；ii．内珠被；M．中层；n．核；oi．外珠被；op．胚珠原基；ov．胚珠；P．壁细胞；PMC．花粉母细胞；pn．极核；SPL．次生壁细胞；st．雄蕊；sty．花柱；T．绒毡层；vc．营养细胞

图版Ⅰ 1．雄性孢原细胞（↑）；2．内层的次生壁细胞发育成为中层和绒毡层，花药壁的发育属于单子叶型；3．小孢子母细胞时期的4层花药壁；4．二分体（↑）时期的花药壁：中层退化，绒毡层原位退化解体；5、6．单核小孢子时期的花药壁，具有纤维化加厚（↑）的药室内壁和宿存的表皮．箭头指向退化的中层；7．二分体；8．四面体型四分体；9．左右对称型四分体；10．单核花粉；11．花粉核有丝分裂后，形成一个大的营养核和一个小的生殖核；12．成熟的二细胞花粉，包含1个营养细胞和1个生殖细胞；13．子房纵切，示胚珠纵向整齐排列；14．子房横切，示中轴胎座，子房3室，每室2列胚珠；15．倒生胚珠；16．胚珠原基．注意内外珠被尚未分化；17．雌性孢原细胞出现在珠心表皮下；18．大孢子母细胞（箭头）．注意胚珠倒生，内外珠被已经分化；珠心壁有2层细胞（包括表皮和1层壁细胞），显示厚珠心；19．大孢子母细胞减数分裂第一次的末期；20．大孢子二分体（箭头）；21．直线形四分体（箭头）；22．四核胚囊．第4核显示于下一张切片；23．成熟胚囊的合点区，显示反足细胞和中央细胞（包括2个极核）；24．图23的放大，显示2个极核的核仁在靠近；25．卵细胞；26．幼花横切．注意外轮雄蕊显示花药和花丝，内轮雄蕊只显示花丝（箭头）。

Explanation of plate：

an．Antipodal cell；ar．Archesporal cell；eg．Egg cell；EN．Endothecium；EP．Epidermis；gc．Generative cell；ii．Inner integument；M．Middle layer；n．Nucleus；oi．Outer integument；op．Ovule primordium；ov．Ovule；p．Parietal cell；PMC．Pollen mother cell；pn．Polar nucleus；SPL．Secondary parietal cells；st．Stamen；sty．Style；T．Tapetum；vc．Vegetative cell

PlateⅠ Fig．1．Male archesporial cell（↑）；Fig．2．The inner secondary parietal cell develops into middle layer and tapetum．The type of anther wall’s development is Monocotyledonous type；Fig．3．Four layers anther wall at the stage of microspore mother cells；Fig．4．The anther wall in the stage of microspore dyads（↑）：the middle layer has degenerated and the tapetum is degenerating in situ；Fig．5，6．The fibrouslythickened endothecium（↑）and persistent epidermis at the stage of uninucleate microspore．The arrowheads point to the degenerated middle layer；Fig．7．Dyads；Fig．8．Tetrahedral tetrads；Fig．9．Bisymmetric tetrads；Fig．10．Uninucleate microspore；Fig．11．Mitosis of uninucleate microspore gave rise to a large vegetative nucleus and a small generative nucleus；Fig．12．Mature pollen grain composed of a vegetative cell and a generative cell；Fig．13．Longitudinal section of the ovary longitudinally arranged ovules；Fig．14．Transverse section of the ovary showing axile placentation．The ovary has three loculi，each of which has two rows of ovules；Fig．15．Anatropous ovule；Fig．16．Ovule primordium．Note that outer and inner integuments are not differentiated；Fig．17．Female archesporal cell appears beneath the epidermis；Fig．18．Megasporocyte（arrowhead）．Note that the ovule is anatropous and the inner and outer integuments have been differentiated．The nucellar wall is made up of two layers of cells（epidemis and one layer of parietal cells），indicating that the ovule is crassinucellate；Fig．19．TelophaseⅠin the meiosis of the megasporocyte；Fig．20．Megaspores dyad（arrowheads）；Fig．21．Linear megaspore tetrad（arrowheads）；Fig．22．Tetranucleate embryo sac．The forth nucleus is shown in the next section；Fig．23．The chalazal domain of a mature embryo sac comprising antipodal cells and central cell that involves two polar nuclei；Fig．24．Enlargement of Fig．23showing two nucleoli of the polar nuclei are approaching to each other；Fig．25．Egg cell；Fig．26．Transverse section of a young flower．Note that both anthers and filaments are shown in the outer whorl of stamens，but only filaments are shown in the inner whorl of stamens（arrowheads）．

图版Ⅰ PlateⅠ