草菇丝氨酸蛋白酶基因在贮藏期表达变化的研究

逯连静+陈明杰+邢增涛+陈国荣

摘 要：采用不覆膜（control）与覆盖厚度为12μm、打6孔聚氯乙烯膜（PVC12-6）的方式分别对草菇进行保鲜贮藏，观察比较其蛋白酶活性，并通过实时荧光定量PCR技术研究草菇在贮藏期丝氨酸蛋白酶（SER）基因表达变化规律。结果表明：（1）control的草菇蛋白酶活性在储藏前期快速增加，在48h酶活性为3.81U/g·min，72h有所下降，但96h达到高峰，为5.80U/g·min；而PVC12-6的草菇蛋白酶活性在贮藏前期缓慢增加，在96h达到高峰，为2.76U/g·min，随后快速下降；在贮藏期间，control的草菇蛋白酶活性一直比PVC12-6高。（2）control的丝氨酸蛋白酶基因表达量在48h达到最大，随后表达量下降较慢，且48h之后的表达量远高于24h的表达量；而PVC12-6的丝氨酸蛋白酶基因表达量在48h达到最高点后迅速下降，48h后的表达量远远低于24h的表达量。

关键词：草菇；实时荧光PCR；丝氨酸蛋白酶；贮藏期

中图分类号 S63 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）08-31-04

Expression of the Serine Protease Gene in Volvariella volvacea during Different Storage Time

Lu Lianjing1 et al.

（1Information Research Institute of Science and Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Abstract：The activity of protease of Volvariella volvacea which were packaged by perforated packaging film were investigated.The expression of the serine protease gene of the samples in different storage time were investigated by real-time quantitative PCR.The results showed that the fruit bodies with non-packaging retainedhighest activity of protease which was 5.80U/g·min at 96h.Another sample reached thehighest activity of protease at 96h.The relative expression of SER gene of all samples exhibited a rapid increase at 48h，then they were continuous decrease.But the rate of decreased expression in control was lower than another sample.This result was coincidence relation with the activity of protease.

Key words：Volvariella volvacea；Real-time quantitative PCR；Perforated packaging film；Storage time

草菇（Volvariella volvacea）不仅含有丰富的营养成分，还有重要的医疗保健作用。草菇属于典型的热带菇，呼吸作用旺盛，采后细胞仍处于活跃状态，其在低温贮藏时会出现自溶现象，不能像其他食用菌一样在低温冰箱中保存，因此其保鲜技术难度较大。鲜菇采后的生化作用都是在各种酶的作用下进行的，研究发现，对草菇贮藏保鲜影响最大的因素之一是蛋白酶[1]，它可以诱导蛋白质发生降解，使大分子蛋白质降解为小分子蛋白质。菇体的腐烂与蛋白质的降解有关，蛋白酶的活性越高，蛋白质降解越也严重，菇体腐烂就越快。而蛋白酶活性与该酶的表达量有一定的关联，如Burton[2]研究发现，双孢蘑菇采收后，其衰老过程中氮源的代谢分解主要靠丝氨酸蛋白酶，该酶的表达量升高比酶活的升高提前24h，且两者具有正相关即表达量越高，酶活也越高。目前国内研究草菇保鲜方法大都采用物理和化学的方法，但未从分子水平深层次进行研究。为此，本试验通过覆盖膜并打孔的方式包装草菇，研究在一定的贮藏期内蛋白酶活性的变化与丝氨酸蛋白酶（SER）基因表达变化规律，从分子水平来探讨蛋白酶表达量与酶活性的相关性，以达到调节酶活性的目的，为今后进一步研究草菇保鲜方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 草菇（V.volvacea）V23子实体材料来自上海宁郁菌菇有限公司，同批采收，采前不喷水，选择成熟度、颜色一致，大小均匀，且无病害无损伤的草菇子实体。聚氯乙烯膜PVC12（厚12μm）购于杭州恩希爱化工有限公司。聚丙烯托盘（165mm×45mm）购于上海中央化学有限公司。

1.2 处理方法 取当天采收子实体，每120g左右（10～12个）装于聚丙烯托盘中，用聚氯乙烯膜包装，并在膜上（面积165mm×115mm）均匀打6个孔（直径1.3mm），以不覆膜为对照组（control），放置在15℃无光照的生化培养箱内，每处理每隔24h取3盒，每盒为1个重复。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶活性测定 参照Chavira等的方法[3]。

1.3.2 草菇子实体总RNA的提取与纯化 草菇子实体总RNA的提取参照汪虹等[4]的方法进行，用DNase处理去除基因组DNA，然后用DEPC处理的双蒸水溶解，-70℃保存备用。

1.3.3 草菇子实体总RNA的RT-PCR 草菇子实体cDNA的合成参照汪虹等[4]的方法。

1.3.4 引物设计 根据草菇gpd基因cDNA全长序列（Genbank登录号：DQ14038）和丝氨酸蛋白酶基因片段序列设计定量引物。

1.3.5 目的片段扩增 采用常规PCR扩增技术，应用表1的引物，进行gpd基因与丝氨酸蛋白酶基因片段的扩增、克隆和测序。

表1 定量PCR引物

[引物＼&碱基数＼&序列＼&Ser-F＼&22＼&5TGCCTTGACCTTTACCTACACC-3＼&Ser-R＼&20＼&5-GCAACACCAAACTGGCTTCC-3＼&god-F＼&21＼&5-GGCTTGATGACCACCGTACAT-3＼&gpd-R＼&24＼&5-GCACCAGTGGAAGATGGAATAATG-3＼&]

1.3.6 制备标准品质粒 构建含gpd基因与SER基因片段的定量PCR标准品质粒，参照汪虹等[4]的方法。

1.3.7 SER基因定量测定 采用双标准曲线法进行定量，可以忽略目的基因Ser和参照gpd扩增效率的不一致。将SER和gpd重组标准品质粒10倍梯度稀释后，分别以系列稀释的质粒为模板进行定量PCR扩增，得到2个基因的标准曲线。以2种处理不同储藏时间的草菇子实体cDNA 2μL为模板分别进行SER基因和gpd基因的定量扩增，每个样品设2个重复。另每批设2μL ddH2O作为模板的空白对照。反应条件为95℃、5s，51℃、10s，72℃、15s，共40个循环。

2 结果与分析

2.1 不同处理对草菇子实体蛋白酶活性的影响 如图1所示，control子实体的酶活性在24h（control子实体在贮藏期腐烂较快，96h后失去实验意义，因此未采集数据）之后陡然上升，除了在24h与PVC12-6的酶活性没有明显差异外，其他贮藏期都存在显著性差异，且在48h达到了贮藏期的一个小高峰，为3.81U/g·min，随后72h有所回落，96h又陡然上升到5.80U/g·min。PVC12-6的子实体蛋白酶酶活性在24h之后的贮藏期都明显低于control，且酶活性上升较慢，只有在96h才达到高峰，仅为2.76U/g·min，随后都逐渐下降。

图1 不同处理对草菇子实体蛋白酶活性的影响

2.2 RNA的提取和目的片段的扩增 提取的草菇子实体RNA经DNase处理去除基因组DNA后，琼脂糖电泳结果表明RNA分子保持完整，以此为模板进行常规PCR扩增目的基因SER和内标基因gpd，琼脂糖电泳在200bp附近获得条带，与预期大小相符（图2），经测序目的条带与原始序列同源性为100%。

[M][1][2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100bp]

图2 SER基因片段

2.3 标准曲线的构建 图3、图4为梯度稀释SER质粒的扩增动力学曲线，由Rotor-Gene3000实时荧光定量PCR仪配套软件自动生成，同时生成标准曲线和回归方程。从标准曲线（图3、4）可以看出，起始模板浓度与CT值之间存在良好线性关系，SER基因标准曲线回归方程为conc=10^（-0.315*CT+10.461），内标基因gpd标准曲线的回归方程为conc=10^（-0.299*CT+8.930），根据标准曲线回归方程可以得到未知样品中目的基因和内标基因起始模板浓度。

图3 丝氨酸蛋白酶质粒扩增曲线

图4 丝氨酸蛋白酶质粒构建标准曲线

2.4 不同处理贮藏期SER基因表达 根据标准曲线回归方程对CT值换算得起始浓度，对目的基因浓度与内标基因浓度比值进行比较，得到2个处理在贮藏期间（0h的SER基因表达量极少，未检测出，因此从24h开始检测）草菇子实体中Ser基因表达量变化（表2、3）。结果显示，2个处理在贮藏期为48h时SER基因表达量都达到一个峰值，之后都持续下降（图5、6）；control子实体的SER基因表达量在48h之后缓慢下降，且表达量都高于24h的表达量；PVC12-6子实体的SER基因表达量在48h达到1.85之后急速下降，且远远低于24h的表达量。

表2 处理中control在不同储藏期草菇子实体SER基因表达量

[15℃下储藏时间（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相对浓度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相对浓度＼&相对

含量＼&24＼&24.61＼&523＼&15.12＼&4266＼&1.00＼&48＼&23.54＼&1118＼&16.17＼&2192＼&4.25＼&72＼&23.07＼&1556＼&15.05＼&4445＼&2.92＼&96＼&22.78＼&1909＼&14.34＼&6990＼&2.25＼&]

表3 处理中PVC12-6在不同储藏期子实体SER基因表达量

[15℃下储藏

时间（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相对浓度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相对浓度＼&相对

含量＼&24＼&18.32＼&2986＼&15.86＼&6199＼&1.00＼&48＼&17.09＼&7802＼&15.36＼&8764＼&1.85＼&72＼&19.83＼&921＼&16.82＼&3197＼&0.60＼&96＼&18.42＼&2757＼&14.90＼&12007＼&0.48＼&120＼&18.86＼&1959＼&15.07＼&10686＼&0.38＼&144＼&19.80＼&942＼&15.93＼&5921＼&0.33＼&]

图5 control在不同储藏期SER基因表达量变化

图6 PVC12-6在不同储藏期SER基因表达量变化

3 结论与讨论

草菇采后后熟作用较强，会继续生长并产生孢子，而采后由于不能从培养料中吸取养分，从而只能靠子实体自身的代谢来维持。草菇采后碳代谢的碳源为子实体的甘露醇、海藻糖和一些糖原[5]，而氮代谢的氮源则主要为可溶性蛋白[6]。据报道，可溶性蛋白的降解伴随着蛋白酶的活性增高，且蛋白酶活性越高菇体腐烂越快，保鲜效果越差。蛋白酶中主要起作用的是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[6]，而Burton等[7]研究表明，菇体在采收后，氮源营养代谢起主要作用的为丝氨酸蛋白酶，该酶导致大分子蛋白质降解为小分子蛋白质，从而加速腐烂衰老。

丝氨酸蛋白酶蛋白首先转录为酶前体，然后必须被水解，其过程为蛋白酶前体通过细胞膜转移，然后其前肽被水解掉即可变为有活性的酶[7]。衰老子实体中的丝氨酸蛋白酶位于胞外还是胞内至今还不清楚，但是双孢菇菌丝中的丝氨酸蛋白酶则位于胞外[8]。因此，丝氨酸蛋白酶的活性升高需要2个条件：一是该酶的基因表达量增大，该酶大量被转录翻译；二是该酶必须经过水解，然后通过细胞膜转移后变为有活性的酶。若该酶被大量转录翻译但被水解掉的酶前体较少，则该酶活性较低；反之若该酶的基因大量转录翻译且其前体被水解掉，则该酶活性较高。

杨淑云等[1]认为草菇在储藏过程中蛋白酶活性增强是导致草菇软腐的原因之一。巫光宏等[9]研究了草菇蛋白酶活性在不同温度下的变化，表明蛋白酶活性越高，草菇越容易腐烂。草菇采后在室温下只能放置1～2d，本实验结果表明，control中的草菇子实体的蛋白酶活性在贮藏期较高，在48h达到了一个小高峰，此时子实体已经出现腐烂衰败现象，96h后则完全失去食用价值，其酶活性达到了贮藏期内最高。但PVC12-6的草菇子实体的蛋白酶活性在贮藏期内较低，最高峰出现在96h，远远低于control酶活性，试验中PVC12-6的草菇在144h内未出现腐烂现象。此研究与巫光宏等的研究结果相一致。

蛋白酶的活性与该酶的基因表达量息息相关。Crawford研究了双孢菇采后储藏期间的丝氨酸蛋白酶的表达，研究表明在刚采后鲜菇中该酶没有表达，而之后储藏第1天时被检测到，且在第2～3天表达量达到峰值。Burton证明了该酶表达量增高后的24h酶活才会升高，在第5天表达量显著降低但是仍然有高的酶活性[9]。相对高的转录和高的翻译水平证明了该酶在食用菌衰老过程中的代谢起到了至关重要的作用。本试验定量测定了2个处理组的草菇子实体丝氨酸蛋白酶基因在贮藏期的表达量，结果表明control的SER基因表达量在24h之后一直较高，且远远高于24h的表达量，与该组蛋白酶活性呈正相关性；PVC12-6子实体的SER基因表达量在整个贮藏期内较低，在48h出现了小高峰之后急速下降，远远低于24h的表达量，这与该组的蛋白酶活性较低呈正相关性；2个处理组的SER基因表达量在48h都存在一个高峰，且蛋白酶活性都在96h存在高峰，此结果与Crawford和Burton研究的结果一致，即酶活性的高峰期（96h）都是在其基因表达量高峰期（48h）1～2d后才出现。

由本次实验表明，草菇在贮藏期的蛋白酶活性越高其腐烂越快，且在贮藏期的蛋白酶活性变化与该酶的基因表达量呈正相关性，即蛋白酶表达量越高则酶活越高，这为今后从分子水平调控酶基因的表达量方面来研究如何抑制生理性酶活，从而为延缓腐烂、延长保鲜期奠定了基础。

参考文献

[1]杨淑云，刘朝贵，曹必好，等.草菇采后生理及保鲜技术[J].生物学杂志，2002，19（4）：35-38.

[2]Burton K.S.，Partis M.D.，Wood D.A.，et al.Accumulation of serine proteinase in senescent sporophores of the cultivated mushroom，Agaricus bisporus[J].Mycol.Res，1997，101：146–152.

[3]Chavira R.Jr.，Burnett T.J.，Hageman J.H.Assaying proteinases with azocoll.Anal[J].Biochem，1984，136：446-450.

[4]汪虹，陈明杰.草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质量和标准曲线的构建[J].食用菌学报，2007，15（3）：16-19.

[5]Hammond J.B.W.，R.Nichols.Changes in respiration and soluble carbohydrates during the post-harvest storage of mushrooms（Agaricus bisporus） [J].Sci.Food.Agric，1975，26：835-842.

[6]Burton K.S.，Love M.E.，Smith J.F.Biochemical changes associated with mushroom quality on Agaricus spp[J].Enzyme Microb.Technol.，1993，15：736–741.

[7]Crawford s.Kingsnorth，Daniel C.Eastwood，Kerry S.Burton.Cloning and Postharvest Expression of Serine Proteinase Transcripts in the Cultivated Mushroom Agaricus bisporus[J].Fungal Genetics and Biology，2001，32：135-144.

[8]Burton K.S.，Smith J.F.，Wood D.A.，et al.Mycelial proteinases of the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J].Mycol.Res.，1997：1341-1347.

[9]巫光宏，詹福建，钱春梅，等.不同温度处理对草菇、真姬菇蛋白酶活性变化的影晌[J].华南农业大学学报（自然科学版），2004，25（2）：71-74. （责编：张宏民）