Ⅱ型胶原基因型变化与 Legg-perthes病发病的相关性研究

孟海涛，李林，王翠苹，曾文超，聂志奎，郭洪敏

(山东省济宁市第一人民医院骨关节科，山东 济宁 272011)

Ⅱ型胶原基因型变化与 Legg-perthes病发病的相关性研究

孟海涛，李林，王翠苹，曾文超，聂志奎，郭洪敏

(山东省济宁市第一人民医院骨关节科，山东 济宁 272011)

目的 使用mRNA探针检测Ⅱ型胶原基因型的变化，酶联免疫吸附法检测血清Ⅱ型胶原抗体浓度，阐明Ⅱ型胶原基因型改变是Legg-perthes病的病因。方法 实验选用健康杂种幼犬20只(年龄为2个月，相当于人3.5 岁)，雌雄不限，采用自身对照方法，任选一侧髋为实验侧，另一侧作为对照侧，实验侧股骨颈内注射医用TH胶1 mL制作Legg-Perthes病动物模型，对照侧注入生理盐水1 mL。于注胶后4、8、12周时分批处死取材，采用mRNA探针检测Ⅱ型胶原基因型及酶联免疫吸附法检测血清Ⅱ型胶原抗体浓度。结果 Ⅱ型胶原基因型及血清Ⅱ型胶原抗体浓度测定发现在第8～12周时实验组与对照组之间均有极显著性差异(P<0.01)。结论 Ⅱ型胶原基因型的改变可能是Legg-perthes病的病因，可能是因为Ⅱ型胶原刺激产生相应抗体发生特异性免疫反应，导致自身免疫攻击，参与Legg-perthe病的发病过程。

mRNA探针；医用TH胶；幼犬；Legg-perthes病

Legg-perthes病，亦称为儿童股骨头软骨炎，是发生于儿童股骨头局部的自愈性自限性疾病，是骨科领域常见的疑难病之一，严重危害儿童的身心健康。其特征是股骨头缺血及不同程度骨坏死，而骨的坏死与修复又是同时进行的，其自然病程大约需要2～4年，病变愈合后往往遗留不同程度的关节畸形和功能障碍，并可能发展为早期骨性关节炎[1-2]，目前尚无统一的评定标准、早期诊断和治疗方法。因此，本研究通过建立幼犬Legg-perthes病模型，观察Ⅱ型胶原基因型及其血清抗体浓度的变化以探讨Legg-perthes病的发病机制。

1 资料与方法

1.1 动物分组 实验选用健康杂种幼犬20只(年龄为2个月，相当于人3.5 岁)，体重3～5 kg，雌雄不限，采用自身对照方法，任选一侧髋为实验侧，另一侧作为对照。

1.2 Legg-perthes病模型的建立 所有动物经过适应性喂养2周后开始造模。幼犬腹腔内注药全麻后，仰卧位固定，无菌操作，实验侧驱血带驱血后放射监控下应用骨穿刺套针经皮于大转子下方向股骨颈中央穿刺达股骨头颈部骺板远侧，注入医用TH胶1 mL。术后相同条件下分笼饲养，给予充足活动空间，注胶后4周、8周、12周时分批处死取材。

1.3 指标检测 动物处死后立即取出股骨头及干骺端，沿冠状面正中剖开，采用mRNA探针检测Ⅱ型胶原基因型及酶联免疫吸附法检测血清Ⅱ型胶原抗体浓度。

1.4 统计学处理 所有实验数据由SPSS统计软件处理。采用独立样本t检验进行组间比较，各组间差异性检验的显著性水平定为P<0.05。

2 结 果

2.1 Ⅱ型胶原基因型检测结果 采用mRNA探针检测Ⅱ型胶原基因型结果显示，实验组股骨头冠状切面Ⅱ型胶原基因型有明显改变，而对照组未见该改变。

2.2 血清Ⅱ型胶原抗体浓度 采用酶联免疫吸附法检测血清Ⅱ型胶原抗体浓度结果见表1。注射医用TH胶后4周，Ⅱ型胶原抗体吸光度较对照组增大；8周时Ⅱ型胶原抗体的吸光度较4周时增大；12周时可见对照组的吸光度未见明显变化，而实验组的吸光度随时间不断增大，且两者的吸光度比值也逐渐增大。

表1 各组动物血清中Ⅱ型胶原抗体浓度的比较

3 讨 论

目前关于Legg-perthes病的发病机理大都局限于局部的血供障碍和脂质代谢障碍出现的脂肪栓塞。最近研究认为Legg-perthes病是一个多种因素共同作用的复杂疾病，Ⅱ型胶原可能是引起Legg-perthes病的原因之一[3]。Ⅱ型胶原主要分布于软骨和眼的玻璃体中，是关节软骨的主要组成蛋白。胶原蛋白相当于骨骺的软组织支架，担负着骨骺细胞的生长，与其营养供应和细胞间信号的调节密切相关。骨骺中胶原蛋白主要为Ⅱ型胶原，当Ⅱ型胶原出现某种变化时，便会导致软骨局部稳定的生理环境发生变化，产生相应的软骨病变，长此以往继而引起骨质病变[4]。

有研究发现，Ⅱ型胶原是一种组织局限性蛋白，主要存在于关节软骨和骨骺中，它是关节软骨的主要组成蛋白。关节损伤或关节内血流受阻时，Ⅱ型胶原释放入血并刺激免疫系统产生自身免疫攻击，推测这可能是关节软骨炎发生机制之一[5]。Miyamoto等[4]报告一个Legg-perthes遗传特征明显的家族，家族三代男、女均有发病。对家族10位成员的外周血基因分析发现，编码Ⅱ型胶原α1链的基因变异是引起Legg-perthes的致病因素。Ⅱ型胶原是软骨细胞增殖、分化过程中合成和分泌的重要胶原，也是关节软骨细胞的标志分子之一。目前，已经发现很多骨骼系统疾病，如成人股骨头坏死、早期发生的骨关节炎等均与Ⅱ型胶原基因变异有关[6-7]。最近的研究发现，通过对病变的股骨头关节软骨行组织学检查确定，软骨组织已经发生了广范的超微结构异常。组织学结果表明，突变体的软骨的层次结构和嵌入式的软骨细胞明显异常。Ⅱ型胶原的表达和分布在突变体的软骨部分不均匀，超微结构检查发现在突变体中的软骨发生明显的软骨细胞和胶原纤维排列紊乱。这说明由于Ⅱ型胶原中的甘氨酸被丝氨酸替代，显著降低了Ⅱ型胶原的稳定性。研究还表明，在Ⅱ型胶原COL2A1中的p.gly1170ser结构突变引起的关节软骨结构明显改变是发生新的胶原基因病的原因[8]。Th免疫应答是此病发生所必需的诱因和主要原因，而且Legg-perthes病的病理变化与之极其相似[9]。与以上研究结果一致，本实验发现Ⅱ型胶原基因型及血清Ⅱ型胶原抗体浓度在第8～12周时实验组与对照组之间均有极显著性差异。由此推测，Ⅱ型胶原基因变异可能是Legg-perthes的致病因素，对Ⅱ型胶原及其血清抗体的进一步研究可为Legg-perthes病早期诊治提供理论依据。

Legg-perthes病往往会遗留不同程度的关节畸形和功能障碍，严重危害患儿的身心健康。因此，研究Legg-perthes的病因、发生机制具有重要的临床价值。

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Changes of Collagen Ⅱ Genotype in Legg-perthes Disease

Meng Haitao，Li Lin，Wang Cuiping，etal

(Department of Joint Sugery，1st People′s Hospital of Jining，Jining 272011，China)

Objective To expore changes of collagen-Ⅱ genotype in Legg-perthes Disease.Methods 20 healthy half-bred young dogs were used.1 ml of TH glue was injected into one hip joint in the experimental group，whereas 1 ml of physiological saline solution was injected into the other hip joint as control.Samples was taken at 4，8 and 12 weeks post injection.mRNA probes was used to detect the collagen genotype changes，and ELISA was used to detect the antibody thickness of collagen-Ⅱ.Results There was an notable difference of collagen-Ⅱ genotype and antibody thickness between the experimental group and the collation group at 8 and 12 weeks post injection (P<0.01).Conclusion The collagen-Ⅱ genotype changes may be one of the causes of Legg-perthes disease.One probable mechamism is that antibody provoked by collagen-Ⅱ lead a immunoreaction and participate in Legg-perthes morbidity process.

mRNA probe；TH glue；young dogs；legg-perthes disease

1008-5572(2015)02-0134-02

R681.8

A

2014-08-25

孟海涛(1976- )，男，主治医师，山东省济宁市第一人民医院骨关节科，272011。