人脐带来源的间充质干细胞再次培养效果观察

高彦琳, 张宁坤, 陈厚良, 高连如, 朱智明

(中国人民解放军海军总医院,北京100000)

·基础研究·

人脐带来源的间充质干细胞再次培养效果观察

高彦琳, 张宁坤, 陈厚良, 高连如, 朱智明

(中国人民解放军海军总医院,北京100000)

目的 探讨人脐带来源间充质干细胞(hUC- MSCs )体外培养的最佳方法。方法 采用组织块贴壁法分离培养hUC- MSCs,记为初次培养组。将原代培养瓶中的培养液及组织离心，重新分成再次培养组织组、再次培养混合组和再次培养纯液组进行再次培养。观察四组原代细胞的细胞形态、获得时间和细胞得率；MTT法绘制细胞生长曲线， 流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。结果 初次培养组、再次培养组织组、再次培养混合组、再次培养纯液组获取细胞的平均时间分别为(15±0.45)d、(7±0.30)d、(8±0.25)d、(8±0.25)d。每个T75培养瓶可获取的第1代细胞数分别为(4.0±0.50)×105、(9.0±0.55)×105、(15.0±0.20)×105、(7.0±0.33)×105个。倒置显微镜下观察四组细胞为形态相对均一的梭形贴壁细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长。四组细胞的生长曲线、增殖活性、表面标记物检测均无明显差异。结论 对脐带间充质干细胞的原代培养体系进行再次培养，可在短时间内扩增出大量原代细胞。

间充质干细胞；脐带；细胞培养

间充质干细胞(MSCs)是进行细胞疗法的主要种子细胞[1], 具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景[2，3]。目前已从骨髓、 脂肪、 羊膜、 胎盘、 脐血以及脐带等组织中分离出MSCs，其有向内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞分化的能力[4～6]。 脐带的来源广泛，取材方便，易于收集、保存、冷冻，属于医疗废弃物，不受伦理、道德及法律方面的限制，且脐带组织中MSCs含量丰富，是再生医学理想的种子细胞[7]。目前分离培养脐带血来源的间充质干细胞(hUC-MSCs )的方法很多，但是都不能快速有效地获取原代细胞。2014年1～5月，我们观察并比较了对hUC-MSCs原代培养体系进行再次培养所获得hUC-MSCs的形态，获得hUC-MSCs 时间及数目，获得hUC-MSCs 细胞表型、增殖能力、周期分布，探讨最佳的hUC- MSCs 培养方法。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 脐带来源 经医院伦理委员会的批准， 在征得产妇和家属书面知情同意的情况下， 在海军总医院妇产科产房取当日剖宫产健康足月生产的新生儿脐带 (乙型肝炎病毒、 丙肝病毒、 人类免疫缺陷病毒、 TP-SX、巨细胞病毒梅毒、艾滋病等传染性疾病检测阴性)。

1.1.2 主要试剂及器材 DMEM/F12培养液、胎牛血清(FBS)、0.25%trypsin-EDTA胰蛋白酶均为美国 Gibco 公司生产；MTT为Sigma公司生产；流式单抗CD45-FITC、CD44-FITC、CD90-PE、 CD105-PE、HLA-ABC-PE、HLA-DR-FITC、CD31-PE 均为美国Biolegend 公司生产；倒置相差显微镜下为日本Nikon公司生产；流式细胞仪为美国 BD 公司生产；紫外分光光度仪、 二氧化碳培养箱(Thermo)。

1.2 hUC-MSCs分离及培养

1.2.1 hUC-MSCs的原代培养 将无菌条件下获取的脐带放入无菌生理盐水中，1 h内送至细胞培养实验室。参照Li等[8]报道的hUC-MSLs分离、培养方法。用生理盐水反复冲洗，洗去脐带残留血液，将脐带剪成3～4 cm的小段，每段均沿脐静脉腔剪开，平铺后剔除静脉，再剔除2根动脉，取出血管之间、血管与外膜之间的胶状物——华通胶，用小剪刀将取出的华通胶反复剪切成大约1 mm3及以下小块，接种于T75培养瓶内，每个培养瓶内加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培养液，使脐带华通胶均匀分布瓶底，置于5%CO2、37 ℃的培养箱内培养。在显微镜下观察细胞生长增殖情况并拍照。待细胞生长至80%～90%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞，为初次培养组。

1.2.2 hUC-MSCs再次培养 将原代培养瓶中的培养液及组织移入离心管中，1 500转/min离心5 min。将此体系分成三组，并分别接种于T75培养瓶内。再次培养组织组：单纯组织块组(无原培养基)加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培养液；再次培养混合组：组织块及原培养基的混合物组加入5 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培养及5 mL原培养液；再次培养纯液组：原培养液10 mL，分别置于5%CO2、37 ℃的培养箱内培养。在显微镜下观察细胞生长增殖情况并拍照。待细胞生长至80%～90%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞。

1.3 观察项目及方法

1.3.1 hUC-MSCs形态、第一代细胞获取时间及数量 采用倒置显微镜观察四组hUC-MSCs形态。统计各组获取第一代hUC-MSCs的时间及每个培养瓶获取hUC-MSCs的数量。

1.3.2 hUC- MSCs 表面标记物 取各组第3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗两次，调整细胞浓度为1×106/mL单细胞悬液，每个Eppembrf 管加 100 μL的细胞悬液 , 加入鼠抗人单克隆抗体 PE- CD90PE- CD105PE- CD44PE-CD73PE- HLA- ABC FITC- CD45FITC- CD34FITC- HLA- DR各 20 μL，充分混匀，避光室温孵育30 min， PBS 洗 2 遍(250 g 离心 5 min )，重新制成细胞悬液 0.5 mL，经300目细胞筛过滤，流式细胞仪上机检测并分析。

1.3.3 细胞增殖活性 取各组第3代细胞， 经0.25%胰蛋白酶消化计数后，分别用完全培养基调整细胞数至2.5 × 104/mL，取200 μL细胞悬液接种在96孔板中,每组设6个复孔，置于37 ℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每隔24 h用MTT法检测各组细胞吸光度值(激发波长490 nm)，连续7 d，取6孔均值绘制生长曲线。

1.3.4 细胞周期分布 取各组第3代细胞，经0.25%胰蛋白酶消化收集后，分别用 PBS 离心洗涤 2 次，调整细胞数至 1×106/mL，离心弃上清，加入4 ℃预冷的70%乙醇1 mL重悬，4 ℃冰箱过夜; 离心弃上清，用1 mL碘化丙啶重悬，4 ℃避光孵育 30 min，流式细胞仪检测，分析细胞周期。

2 结果

2.1 hUC-MSCs形态、得第一代细胞获取时间及数量 倒置显微镜下观察四组原代细胞呈贴壁生长，形态均为长梭形或多角形1。初次培养组细胞以华通胶为中心呈旋涡状或平行排列生长，获取细胞的时间为(15.00±0.45)d,每个培养瓶可获取(4.00±0.5)×105个第一代细胞；再次培养组织组细胞以华通胶为中心呈旋涡状生长，获取细胞的平均时间为(7.00±0.3)d,每个培养瓶可获取(9.00±0.55)×105个第一代细胞；再次培养混合组部分细胞以华通胶为中心呈旋涡状生长，部分细胞呈散在生长，得到原代细胞的时间(8.00±0.25)d,每个培养瓶可获取(15.00±0.20)×105个第一代细胞；再次培养纯液组细胞呈散在生长，得到原代细胞的平均时间(8.00±0.58)d,每个T75培养瓶可获取(7.00±0.33)×105个第一代细胞。传至第3 代， 细胞增殖速度加快，形态较为均一呈长梭形，折光度好。四组第一代及第3代hUC-MSCs细胞形态无明显差异，初次培养组原代细胞获取时间显著长于其他三组(P均<0.05)，再次培养的三组之间两两比较，P均>0.05。获取原代细胞数再次培养混合组数目最多，再次培养组织组其次，再次培养纯液组稍差，初次培养组最少，四组间两两比较P均<0.05。

2.2 hUC-MSCs免疫表型 四组第3代脐带间充质干细胞均高表达CD90、CD105、HLA-ABC，不表达 CD31、CD34、CD45、HLA- DR。

2.3 hUC-MSCs增殖能力 四组第3代hUC- MSCs细胞生长曲线见图1。四组hUC- MSCs 生长曲线形态相似，基本重叠。第1～2 d各组细胞处于潜伏期，增殖不明显; 3～5 d各组细胞进入对数生长期， 细胞增殖加速; 第 6 天以后进入平台期，细胞生长停滞。

图1 四组hUC-MSCs 生长曲线

2.4 hUC-MSCs细胞周期分布 各组细胞周期分布无统计学差异。

3 讨论

最近几年里，对成体干细胞疗法的研究在不断增加。MSCs是一个相当具有吸引力的种子细胞，可以用于治疗各种疾病，包括神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病等[9]。hUC- MSCs 是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的原始干细胞，分化能力强，倍增时间短，具有免疫调节作用和较低的免疫原性，且无致肿瘤性[10，11]。1976年Friedenstein等[12]首先从脐带组织中分离培养出间充质干细胞，之后Schugar等[13]采用组织块法和酶消化法两种方法分别培养出脐带间充质干细胞，这也是目前较为常用的两种方法。这两种方法分离培养出的脐带间充质干细胞形态、 生长曲线、 细胞表面标记物等无明显差异[14]。但是酶消化法成本较高；操作比较繁琐污染概率大；消化过程时间过短，细胞很难爬出；消化时间过长易损伤细胞；长时间酶的消化对细胞损伤较大, 多次传代后细胞易脱落死亡[15]。

本研究采用组织块培养法提取脐带中MSCs。通常来讲组织块贴壁法是将小的组织块均匀铺于培养瓶底，原代细胞从组织块边缘爬出。虽然组织块贴壁法方便易行，操作简单，但存在原代细胞收获率低、培养周期长等问题[16]，难以适应组织工程对种子细胞的需要。本研究中初次培养组获取原代细胞的平均时间大约2周,获取细胞数量较少，符合组织块贴壁法培养的结果。一般传代结束后就会将培养原代细胞的组织和培养液丢弃。本研究中笔者将废弃的组织和培养液离心后，分成组织组、混合组和纯液组进行再次培养，大约1周即可传代，且获取的细胞数为初次培养的2倍左右。相对于传统组织贴壁法，这种改进的方法可在较短时间内获得大量原代细胞，而且获得细胞的免疫表型、增殖能力及周期分布正常。笔者推测其原因：①初次培养后组织块内细胞并未完全爬出；②初次培养过程中可能形成了某些黏附物质和生长因子，促进组织块贴壁和生长[17]；③组织块在经过一轮培养后，纤维组织松解，细胞易于爬出；④原代培养的培养液中可能存在一些散在细胞。

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国家自然科学基金面上项目(81170094)。

朱智明

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.010

R318

A

1002-266X(2015)06-0028-03

2014-10-15)