氢气对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制

刘雪聪 ，刘福林，李志林，周晓东，申文增，周程

(1河北大学附属医院，河北保定071000；2河北大学化学院；3河北大学生理教研室)

·论著·

氢气对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制

刘雪聪1，刘福林1，李志林2，周晓东1，申文增3，周程1

(1河北大学附属医院，河北保定071000；2河北大学化学院；3河北大学生理教研室)

目的 探讨氢气对心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 将48只大鼠随机分为实验组和对照组各24只。取两组大鼠心脏，按逆灌注10 min，常温旷置20 min、再灌注20 min的方法建立心肌缺血再灌注模型。对照组灌注液用K-R液，实验组灌注液用K-R液+氢气饱和生理盐水。监测两组大鼠心脏缺血前期、缺血期、再灌注期心肌组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平及左室舒张末期压力(LVEDP)。结果 对照组缺血期心肌MDA水平高于缺血前期(P<0.05)，再灌注期心肌MDA水平低于缺血期(P<0.05)，但仍高于缺血前期(P<0.05)。实验组各期心肌MDA水平无统计学差异；缺血期、再灌注期心肌MDA水平较对照组同期下降(P均<0.05)。两组缺血期与缺血前期心肌SOD水平无统计学差异，缺血再灌注期心肌SOD水平低于缺血前期和缺血期(P均<0.05)。实验组缺血期与再灌注期心肌SOD水平较对照组同期升高(P均<0.05)。对照组再灌注期LVEDP高于缺血前期(P<0.05)；实验组再灌注期与缺血前期LVEDP无统计学差异，但与对照组同期比较下降明显(P<0.05)。结论 氢气对大鼠离体心脏心肌I/R损伤有明显的保护作用。其机制可能为抑制心肌组织MDA表达，提高心肌组织SOD水平。

心肌缺血再灌注损伤；氢气饱和生理盐水；丙二醛；超氧化物歧化酶

体外循环下心脏直视手术时心脏会经历缺血再灌注(I/R)的过程，而I/R损伤会引起心肌顿抑、心律失常等[1]。研究证实，自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、细胞凋亡等均可参与心肌I/R损伤。氢气对羟自由基及过氧亚硝基等阴离子有中和作用[3]，可作为抗氧化剂用于脑缺血所致的I/R损伤[4]。2014年6～10月，我们观察了氢气饱和盐水对大鼠离体心脏I/R损伤的保护作用，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为 Wistar大鼠48只，雌雄不限，体质量200～350 g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，合格证号：SCXK-(军)2009-003。实验用氢气为自制，由河北大学化学院李志林老师提供(制备技术已获得国家专利，专利号ZL102557227B)，氢气饱和生理盐水(pH值为7.3)；丙二醛(SOD)、超氧化物歧化酶(MDA)检测试剂盒和考马斯亮蓝蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及干预 将48只大鼠随机分为对照组与实验组，每组24只。 按大鼠体质量注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉、肝素(250 U/kg)抗凝。待麻醉起效后，迅速沿剑突下肋缘剪开腹壁并打开膈肌，同时将两侧腋前线剪开胸壁并将其上翻至头侧，在不影响主动脉的情况下，摘取心脏，立即放入4 ℃冰盐水中，并轻压心脏，洗去血迹。将离体心脏按逆灌注10 min、常温旷置20 min、再灌注20 min的顺序进行I/R。行主动脉插管并将离体心脏固定于Langendorff装置，将预先用氧平衡的37 ℃灌注液以7.85 kPa灌注压进行心脏灌注，同时在左心耳处剪一小口，并经二尖瓣处将带有乳胶气囊的测压管插入左心室，同时连接BL-420生物技能实验系统，将气囊内压力调至7 mmHg 。对照组采用K-R液灌注，实验组采用K-R液+氢气饱和生理盐水(5 mL/kg，pH值为7.3)灌注。

1.2.2 相关指标观察 两组均于缺血前期、缺血期和再灌注期各取8个离体心脏，将心肌组织剪下，并经生理盐水漂洗后匀浆。采用721型分光光度计比色测定心肌组织MDA、SOD水平，严格按试剂盒说明书操作；采用BL-420生物技能实验系统记录缺血前期及再灌注期左室舒张末期压力(LVEDP)。

2 结果

两组各期LVEDP及心肌组织MDA、SOD水平见表1。由表1可见，对照组缺血期心肌MDA水平高于缺血前期(P<0.05)，再灌注期心肌MDA水平低于缺血期(P<0.05)，但仍高于缺血前期(P<0.05)。实验组各期心肌MDA水平无统计学差异；缺血期、再灌注期心肌MDA水平较对照组同期下降(P均<0.05)。两组缺血期与缺血前期心肌SOD水平无统计学差异，缺血再灌注期心肌SOD水平低于缺血前期和缺血期(P均<0.05)。实验组缺血期与缺血再灌注期心肌SOD水平较对照组同期升高(P均<0.05)。对照组再灌注期LVEDP高于缺血前期(P<0.05)；实验组再灌注期与缺血前期LVEDP无统计学差异，但与对照组同期比较下降明显(P<0.05)。

表1 两组I/R过程中心肌MDA、SOD水平及LVEDP比较

3 讨论

本研究结果显示，氢气可降低心肌中MDA，提高SOD活性，改善缺血再灌注大鼠的心功能。此种心肌保护作用可能与之前报导的大脑损伤模型中分子氢选择性清除活性氧簇(ROS)有关[5]。I/R过程中心肌细胞可产生一系列活性氧簇(ROS)，其中羟自由基(·OH)和过氧化亚硝酸阴离子(ONOO-)是有害自由基，可与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应，其产物可破坏具有重要功能的生物大分子(如DNA、蛋白质、脂类等)的结构和功能。导致致死性的再灌注损伤[6～8]。线粒体是产生ROS的主要部位，而一些大分子进入线粒体困难[9]。研究发现，氢气可清除氧自由基[5]。氢气分子是电中性的，分子量小于氧气分子，可穿过细胞膜进入细胞核和细胞器如细胞核及线粒体中。氢分子能够通过细胞膜进入胞内清除自由基，这一特性是其他抗氧化剂所不具备的[5]。本研究实验组心肌组织MDA水平低于对照组，SOD活性高于对照组，证实氢气饱和生理盐水对离体心脏心肌I/R损伤有保护作用，其机制可能为迅速使心肌细胞氢气浓度上升，氢气减少了ROS的产生、稳定线粒体膜电位、维持ATP稳定的合成、避免了DNA损伤、降低了脂质过氧化物MDA生成，从而保护了心肌。其中发挥保护作用的最根本机制可能是抑制线粒体通透性转换孔开放[10，11]。

心肌缺血后心功能的变化表现为静止张力(如LVEDP)随缺血时间的延长逐渐增高(表现为LVEDP升高)，再灌注时继续增高；缺血心肌在恢复血液灌注后一段时间内出现可逆性收缩功能减低现象，称之为心肌顿抑。本研究结果显示，实验组再灌注期LVEDP低于缺血前期和对照组再灌注期，表明氢气可以降低I/R导致的心肌顿抑程度，促进患者心功能恢复。氧化应激是引起心肌I/R损伤的首要因素。减轻氧化应激被认为是保护心肌细胞的重要措施。氢气的易扩散性可以使其与羟自由基反应产生成水[12]，所以可以清除ROS。在以前的医学应用中氢气仅限于检测抗菌治疗的效果[13]。虽然也有动物实验研究证明其他的给氢方式可以有效清除活性氧，但进入临床研究后几乎都失败了[14]。近年来，随着氢气在生物体内功能的深入研究，人们发现其在减轻心肌I/R损伤中具有明显的作用[15]。基于以上理论基础，本研究通过建立离体Langendorff模型，对氢气饱和生理盐水在心肌I/R损伤中的作用做进一步研究，为找寻体外循环中所造成的心肌I/R的保护方法，将为氢气饱和生理盐水用于体外循环心脏直视手术的心肌保护提供实验资料。本研究结果显示，氢气饱和生理盐水可减轻心肌I/R损伤，提高左心室舒张压及收缩压，但由于实验仍处于基础研究水平，还需进一步研究明确其临床应用效果。

[1] 刘福林,周玉娟,武变英.1,6-二磷酸果糖对心肌缺血再灌注损伤的保护[J].心血管病学进展，2004,25(5):342-344.

[2] 王永维,韩敏.舒血宁治疗老年冠心病心肌缺血10例临床观察[J].吉林大学学报：医学版， 2013,39(3):502.

[3] 刘颖,孙强,张威,等.氢气饱和生理盐水对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].第二军医大学学报,2010,31(3):238-241.

[4] 孙学军,J Zhang JH.氢—一种内源性抗氧化剂[J].第二军医大学学报,2008,29(3):233-235.

[5] Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nat Med, 2007,13(6):688-694.

[6] Zweier JL, Flaherty JT, Weisfeldt ML. Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84(5):1404-1407.

[7] Bolli R, Patel BS, Jeroudi MO, et al. Demonstration of free radical generation in "stunned" myocardium of intact dogs with the use of the spin trap alpha-phenyl N-tert-butyl nitrone[J]. J Clin Invest, 1988,82(2):476-485.

[8] Vanden-Hoek T, Becker LB, Shao ZH, et al. Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion[J]. Circ Res, 2000,86(5):541-548.

[9] Maher P, Salgado KF, Zivin JA, et al. A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke[J]. Brain Res, 2007,1173:117-125.

[10] Javadov S, Karmazyn M. Mitochondrial permeability transition pore opening as an endpoint to initiate cell death and as a putative target for cardioprotection[J]. Cell Physiol Biochem, 2007,20(1-4):1-22.

[11] Griffiths EJ, Halestrap AP. Mitochondrial non-specific pores remain closed during cardiac ischaemia, but open upon reperfusion[J]. Biochem J, 1995, 307(1):93-98.

[12] Labiche LA, Grptta JC. Clinical trials for cytoprotection in stroke[J]. Neuror, 2004,1(1):46-70.

[13] Sobko T, Elfstrom K, Naver L, et al. Intestinal hydrogen and nitric oxide gases in preterm infantseffects of antibiotic therapy[J]. Neonatology, 2009,95(1):68-73.

[14] Bolli R, Becker L, Gross G, et al. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy[J]. Circ Res, 2004,95(2):125-134.

[15] Sun Q, Kang ZM, Cai JM, et al. Hydrogen-rich saline protects myocardium against ischemia/reperfusion injuryin rats[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2009,234(10):1212-1219.

Protective effects of hydrogen saturated saline alleviating myocardial ischemia reperfusion injury in rats

LIUXue-cong1,LIUFu-lin,LIZhi-lin,ZHOUXiao-dong,SHENWen-zeng,ZHOUCheng

(AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,China)

Objective To explore the protective effects of hydrogen saturated saline in induced myocardial ischemia reperfusion injury in rats. Methods Forty-eight rats were divided randomly into the experimental group (24) and the control group (24). The rats of experimental group were treated with K-R solution combined with hydrogen saturated saline, the controls were given K-R solution only. After the treatment, the hearts were excised rats and Langendorff model. And the heart of the in vitro by inverse perfusion for 10 minutes, normal temperature place for 20 minutes, 20 minutes of reperfusion.The solution of the cardiac muscle tissue of the rats were treated with saline and then the accounts of malondialdehyde (MDA)and the activity of superoxide dismutase(SOD) , and the changes of left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were determined to compare the different protective effects. Results The accounts of MDA in the control group were the highest, there was a significant difference between the experimental group and the controls concerning with the results of ischemia period and reperfusion period (P<0.01,P<0.05). There were differences among the ischemia period and reperfusion period and preischemia period in the control group(P<0.05). In the experimental group, there was not significant difference among the ischemia period and reperfusion period and the preischemia period. There was a significant difference between the experimental group and the controls considering the activity of SOD (P<0.01). The accounts of LVEDP of the control group was obviously high (P<0.05). The level of LVEDP in experimental group was obviously lower than in the control group (P<0.05),but had no significant difference to ischemia period. Conclusion Hydrogen rich saline is quite effective in alleviating myocardial ischemia reperfusion injury.

myocardial ischemia reperfusion injury；hydrogen-rich saline; malondialdehgde; superoxide dismutase

河北省2013年医学科学研究重点课题计划项目(20130369)。

刘雪聪(1987-)，男，在读硕士，研究方向为心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉粥样斑块易损性和冠心病的外科治疗。E-mail：314678161@qq.com

刘福林(1966-)，男，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉粥样斑块易损性和冠心病的外科治疗。E-mail：lful666@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.001

R34

A

1002-266X(2015)06-0001-03

2014-12-13)