小麦镉胁迫相关microRNA的差异表达

邱宗波，袁萌萌，张曼曼，张 亮，郭君丽

（河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡453007）

microRNAs（miRNAs）是一类长度为21～24个核苷酸（nt）的非编码单链RNA 分子，广泛存在于植物、线虫和人类等真核生物细胞中[1－2]，而且在真核生物生长发育、形态建成、信号转导、胁迫响应等重要生命过程中起着关键的调控作用，是最主要的转录后调控因子之一[3－4]。miRNA 通过与靶基因mRNA 序列互补结合来介导mRNA 的降解或抑制mRNA 的翻译，主要在转录后水平负调控靶基因的表达。此外，植物miRNA 还具有保守性、时序性和组织特异性[5]，在个体发育的不同时期或不同组织中有不同的表达模式。研究miRNAs的表达常用Northern杂交、microarray、半定量RT－PCR和实时定量PCR（qRT－PCR）等，qRT－PCR 检测基因表达灵敏度高、快捷、高效。目前，qRT－PCR 在基因表达研究中已成为最重要的方法之一。

研究表明，miRNA 在植物对重金属镉胁迫的响应过程中发挥重要作用[4，6－8]。Xie等[8]用表达序列标签及生物信息学方法预测甘蓝型油菜（Brassicanapus）中的21个miRNA，并且采用RT－PCR方法发现miR156、miR171、miR393 和miR396a的转录受重金属镉的抑制，暗示这几个miRNA 在重金属镉胁迫响应中发挥作用。利用miRNA 微阵列芯片技术，Fang等[9]鉴定了经镉处理和未处理的大豆（Glycinemax）株系中miRNA 表达模式的差异，共鉴定出26个与镉应激相关的miRNA，其中有9个miRNA 在2 个 株 系 中 均 有 发 现，有5 个 和12 个miRNA 分别在镉耐受型和镉敏感型大豆中特异表达。这些研究结果表明，不同植物参与响应镉胁迫应答过程的miRNA 存在多样性。目前miRNAs胁迫表达的研究主要集中在拟南芥、水稻和毛白杨等模式植物上，对小麦镉胁迫相关miRNAs的研究鲜有报道。为此，笔者等在前期已完成的小麦镉胁迫miRNA 表达谱高通量测序的基础上，结合其他植物中已报道的与镉胁迫相关的miRNAs，选择9条可能与镉胁迫相关的小麦miRNA 进行研究，并对其靶基因进行预测及功能分析，以期为进一步明确这些miRNAs的表达调控机制以及揭示小麦体内miRNA 响应镉胁迫的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦（TriticumaestivumL.）品种为郑麦4号，由河南省农业科学院提供。

1.2 胁迫处理

选取籽粒饱满、大小均匀的种子用0.1%HgCl2消毒1min后用去离子水冲洗30min，自然干燥，然后置于25℃恒温箱中浸种36h，播种在铺有2 层滤纸的培养皿中催芽，80 粒／皿，出芽后培养于（25±1）℃人工气候室内，浇以Hoagland’s 营养液，12h／d光照，相对湿度70%。待幼苗长生长7d（1叶一心）时，开始镉胁迫处理。设置营养液中CdCl2浓度为150μmol／L，每天更换1次培养液，试验设3次重复。镉胁迫处理0h、6h、12h、24h和48h后分别取小麦幼苗叶片和根，立即用液氮处理，－80℃保存。

1.3 总RNA提取

用Concert Plant RNA Reagent（Invitrogen，美国）提取镉胁迫小麦幼苗的叶片和根为材料的总RNA，总RNA 用Promega 公 司 的RNase－free Dnase I去除污染的DNA。取3μL 总RNA 溶液，用常规琼脂糖凝胶电方法检测其完整性。通过230 nm、260nm 和280nm 波长的光吸收值测定，检验所提取RNA 纯度和浓度。

1.4 实时定量PCR扩增

1.4.1 实时定量PCR 引物设计 选择小麦中9个 保 守 miRNAs （miR167，miR169，miR171，miR319，miR395， miR396， miR397， miR399，miR444）进行检测，包括之前报道过的植物镉胁迫相关miRNAs或小麦中高度保守的miRNAs，内参基因选用小麦延伸因子1a－亚基 （TEF1）（GenBankaccession No.M90077.1）。引物设计（表1）中尽可能使所有引物具有相同的Tm 值，以便同一批检测。对于GC含量较高或较低的miRNAs，可通过增加或减少引物长度使Tm 值相近或一致，引物合成均在北京六合华大基因科技有限公司进行。

表1 Real－time PCR中使用的引物Table 1 Primers of Real－time PCR

1.4.2 实时定量PCR 扩增 应用Ncode miRNA第一链cDNA 合成试剂盒（MIRC－50；Invitrogen）和1μg纯化后的总RNA 进行cDNA 合成。采用Toyobo’s Thunder bird SYBR qPCR 试剂盒进行定量分析。反应体系为20μL，2μL 1∶10稀释的cDNA 作为模板，引物浓度为0.3μM。每个样品均重复3 次，荧光定量PCR 仪为Rotor－Gene 3000。PCR 循环条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环，PCR 扩增之后，用热变性循环测定熔解曲线验证扩增的特异性。以小麦TEF1为内参基因，扩增的结果用比较Ct方法分析[10]，即采用公式2－ΔΔCt（Ct代表循环阈值）。miRNA 表达水平用TEF1 基因的表达水平进行校正，在CK 中的表达水平设为1。

1.5 miRNA靶基因预测

基于网站程序psRNATarget 进行小麦保守miRNA 靶基因的预测。靶基因数据库为小麦的unigene序列 [DFCI Gene Index（TAGI），version 12，ftp：／／occams.dfci.harvard.edu／pub／bio／tgi／data／Triticum＿aestivum／TAGI.release12.zip]。选择功能3 和默认参数，进行miRNA 靶基因预测[11]。

2 结果与分析

2.1 不同处理小麦幼苗总RNA提取

试剂盒提取总RNA 后，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。从图1看出，不同处理样品的28SrRNA 和18SrRNA 电泳条带分离清晰，无扩散现象，且28SrRNA 条带的亮度约为18SrRNA 条带亮度的2倍。说明，所提取的总RNA 完整性好，没有明显降解，能够用于qRT－PCR 的后续研究。

2.2 qRT－PCR熔解曲线

图2给出了部分qRT－PCR 程序分析得到的熔解曲线。可以看出，10个基因呈现的熔解曲线均为显著的单一峰，扩增曲线清晰可辨。说明，cDNA 扩增产物非常专一，可用于后续定量分析实验。

图1 不同处理小麦幼苗总RNA的琼脂糖电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated from wheat in different treatment

图2 10个基因的Real－time PCR熔解曲线Fig.2 Real－time PCR melting curves of 10genes

2.3 镉胁迫小麦幼苗叶片中miRNA的相对表达量

从表2看出，在镉胁迫6h后，miR169、miR171和miR319表达上调，而miR397和miR399的表达下调。在镉胁迫12h 后，miR319 的表达上调，而miR397、miR399 和miR444 的表达下调。在镉胁迫24h 后，miR319、miR396 和miR397 的 表 达 上调，miR399 的表达下调。在镉胁迫48h后miR319和miR396的表达上调，miR397和miR399的表达下调。其中，miR319在镉胁迫处理各时间段的表达均上调，而miR399在镉胁迫处理各时间段的表达均下调。说明，在同一镉胁迫时间下，不同miRNA在小麦幼苗叶片中的表达量有很大的差异。

2.4 镉胁迫小麦幼苗根中miRNA的相对表达量

从表2看出，在镉胁迫6h 后，miR169、miR396和miR397的表达上调，而miR167和miR171的表达下调；在镉胁迫12h后，miR396和miR397的表达上调，而miR167的表达下调；在镉胁迫24h后，miR169、miR171、miR319 和miR397 的表达上调，miR167和miR444的表达下调；在镉胁迫48h 后，miR169、miR397 和miR399 的表达上调，miR167、miR171和miR444 的表达下调。其中，miR167 在镉胁迫处理各时间段的表达均下调，而miR397在镉胁迫处理各时间段的表达均上调。说明，在同一镉胁迫时间下，不同miRNA 在小麦幼苗根中的表达量有很大的差异。

表2 小麦幼苗叶片和根中镉胁迫相关miRNA的相对表达量Table 2 Relative expression（fold difference）of cadmium stress related microRNA in leaves and roots of wheat seedlings

表3 镉胁迫相关miRNA的靶基因Table 3 Targets of cadmium stress related microRNA

2.5 小麦镉胁迫相关miRNA靶基因的预测

植物miRNA 与靶基因的高度互补有利于预测靶基因。除miR169和miR399没预测出相应的靶基因外，其他6条小麦miRNAs共预测出7个潜在的靶基因（表3）。其中，miR167靶基因为生长素应答因子，参与生长素信号途径的调控；miR171靶基因为超氧化物歧化酶，在清除超氧化物的过程中发挥重要作用；miR319靶基因为2个MYB转录因子基因，参与植物逆境胁迫应答响应[12]；miR395靶基因腺苷5′三磷酸硫酰酶，参与硫的吸收与同化[13]；miR444和miR397的靶基因钙调素结合蛋白，参与钙－钙调素信号传导途径的调控[14]。

3 结论与讨论

1）本研究利用实时定量PCR 方法，对9 个miRNAs在小麦镉胁迫不同时间段的表达模式进行分析，初步发现9个miRNAs参与了小麦镉胁迫响应 的 调 控。 其 中，miR167、miR171、miR399 和miR444在镉胁迫后的小麦幼苗的根或叶中表达呈下调趋势，而miR319、miR396和miR397在小麦幼苗根和叶片中的表达呈上调趋势。表明，miRNAs参与了小麦镉胁迫响应的调控，对镉胁迫不同时间段的响应呈现出动态变化的过程，且多数miRNAs的表达具有组织特异性。

有研究表明，miRNA 参与各种各样的调节途径，包括激素调节、生长发育、信号转导以及逆境环境的适应能力等[3－4]。在植物中，干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫能影响基因在植物内转录及转录后水平的表达调控[15]。镉是毒性最强的重金属之一，可以使植物细胞内产生活性氧（ROS）从而导致氧化胁迫，或者使细胞内蛋白质的羧基或硫醇基失活，从而严重影响植物细胞的生长发育[16]。miRNA 在植物对重金属胁迫的响应过程中发挥重要作用，在重金属胁迫下，植物miRNA 表达量发生显著上调或下调，以响应重金属胁迫[17－18]。Zhou等[19]在豆科的模式生物蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）中，应用实时定量PCR 方法发现了部分miRNA 的表达可受重金属镉的诱导与调节，其中，miR171、miR319和miR529 在镉胁迫下表达上调，而miR167、miR399则表达下调。

2）植物miRNA 功能的发挥主要通过下游靶基因的表达调节而实现。miR167的靶基因是生长素响应因子ARF6 和ARF8[20]，镉处理下miR167在小麦幼苗根中的表达减弱，推测miR167可能通过影响生长素信号途径而在抵抗镉胁迫等过程中发挥重要作用。miR395 通过调节ATP 硫酸化酶的表达而参与硫酸盐同化和分配[21]。缺硫能够诱导拟南芥miR395的表达[22]，本研究也证实镉胁迫同样能诱导小麦幼苗叶和根中miR395 的表达。Sunkar等[23]发现，拟南芥在高铜、高镉胁迫下，miR398 表达降低，其所调控的Cu／Zn 超氧化物歧化酶表达上调，从而提高了拟南芥对重金属胁迫的耐受性。在小麦中，经过镉胁迫处理后的miR171的表达在胁迫处理时间段的表达趋势整体下调，而其在小麦中的靶基因是超氧化物歧化酶。当小麦遭遇镉胁迫时，miR171表达下调，而其靶基因超氧化物歧化酶的表达上调，从而提高了小麦对重金属胁迫的耐受性。另外在预测结果中也发现miR319靶基因为2个MYB转录因子基因，miR444靶基因钙调素结合蛋白和miR397靶基因钙调素结合蛋白。丁艳菲等[7]研究发现，miR444d 在镉胁迫下表达下降，暗示其靶基因钙调素结合蛋白表达上升。本研究表明，miR444在镉胁迫小麦幼苗根中的表达呈下降趋势，暗示其靶基因钙调素结合蛋白表达上升，这一结果首次通过miRNA 将钙信号与镉胁迫应答网络联系起来。miRNA 处于基因表达调控的中心位置，在植物对重金属胁迫的应答过程中起着重要调控作用。

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