优良玉米杂交种金玉818指纹图谱构建及其纯度鉴定

兰琴英，陈泽辉，祝云芳，王安贵，郭向阳，胡 兴，陈建军

（1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳550025；2.贵州省旱粮研究所，贵州 贵阳550006）

种子质量是综合种子不同特性而形成的一种概念，包括品种质量（真实性和纯度）和播种质量（净、壮、饱、健、干、强等）[1]。品种的真实性和纯度是评价种子质量的重要指标[2]。随着我国种子市场的开放，部分营销商在利益驱动下以劣充优，销售假冒伪劣品种，不仅影响品种优良遗传性状的充分发挥，导致作物产量和质量下降，还对国家、企业和农民造成巨大损失。品种的真实性检验和纯度鉴定是防止假冒伪劣种子进入市场的重要手段[3]。因此，建立简便、经济、快速、准确的玉米种子真实性和纯度鉴定技术对种子生产经营部门和广大农民具有重要意义。传统的种子真实性和纯度鉴定技术侧重形态及生理生化特征的区别，具有简单、经济的特点，但是耗时耗力。DNA 分子标记技术的不断成熟，为在分子水平上鉴定作物品种提供了有力的工具。DNA分子标记技术本质上指能反应生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA 片段[4]，其大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA 差异，因此也称DNA 指纹图谱[5]。DNA 指纹图谱技术侧重检测DNA 分子水平差异，可克服常规鉴定技术的不足。DNA 指纹技术所用标记有RFLP 标记、RAPD 标 记、AFLP 标 记、ISSR 标 记、SSR 标 记 和SNP标记。基于SSR 标记具有数量几乎无限，信息含量高，多数为共显性标记，重复性好，多态性检出的频率极高，需DNA 样品量少，对DNA 质量要求不高，实验程序简单等优点，成为鉴定品种真实性和纯度最广泛的分子标记[6－7]。

近年来，前人在利用SSR 标记构建玉米DNA指纹图谱的研究方面作了大量工作，均认为利用SSR 标记技术鉴定玉米品种真实性和纯度的方法是可行的。赵久然等[8]从158对SSR 引物中筛选10对核心引物用于构建玉米自交系和杂交种指纹库，为玉米品种鉴定提供了很大方便；李晓辉等[9]用50对SSR 引物构建86个玉米杂交种的DNA 指纹图谱数据库，确定10对核心引物和判别标准用于亲子鉴定研究；邱红波等[10]利用86对SSR 引物分析了36份喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系的多态性，确立34对核心引物用于该地区玉米骨干自交系的真实性和纯度鉴定；盖树鹏等[11]从74对SSR 引物中筛选出10对和20对分别构建了35份骨干自交系和19份主栽杂交种的指纹图谱；刘龙州、沈童伟、郭向阳、王 安 贵 等[12－15]将SSR 标 记 用 于 玉 米 品种真实性及纯度鉴定研究。

金玉818 是贵州省旱粮研究所用自选系QB506作父本、T32 作母本组配而成的玉米杂交种，2010年通过贵州省农作物品种审定委员会审定，2011年通过云南省农作物品种审定委员会审定。金玉818具有高产、稳产、优质、抗病性强、耐旱性好和籽粒商品性好等特点，深受农民的喜爱。在国家农业科技成果转化资金和贵州省科技成果重点推广计划项目资助下，2011—2014年在贵州及云南的种植面积超过33 000hm2以上。为鉴定市场流通的金玉818种子的真实性和纯度，笔者等通过选用40对国家标准SSR 引物对金玉818进行DNA 指纹图谱分析，试图从中筛选能有效鉴定金玉818真实性和纯度的SSR 引物，以期为快速、准确鉴定金玉818真实性和纯度提供依据，为金玉818品种保护和规范其销售市场提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 标准玉米杂交种金玉818及其亲本T32和QB506用于纯度鉴定，废弃的杂交种金玉818用于纯度鉴定，供试材料均由贵州省旱粮研究所提供。

1.1.2 主 要 试 剂 dNTP、TagDNA 聚 合 酶、MgCl2、10×缓冲液等购自北京天根生物技术有限公司，其他试剂均购自上海生工生物技术有限公司。

1.1.3 选择的SSR 引物 农业部指定的玉米SSR 标准引物40对（表1），引物由上海生工生物有限公司（Sangon）合成。

1.2 DNA提取

参考Saghai－Maroof，M.A.等的CTAB 法并加以改进[16]。

用于指纹图谱构建的DNA（大量提取）：取标准金玉818及其亲本材料种子于25℃恒温培养箱培养7d，待玉米长到4叶一芯时，称取20株单株的混合叶片0.2g于研钵加液氮研成粉末，加入1 mL 65℃预热好的2%CTAB（含1%β－me），转移到2mL PE管；65℃水浴30 min，期间上下颠倒2 次，取出冷却至室温；加入等体积（1 mL）的氯仿：异戊醇（24∶1），上 下 颠 倒10 min，10 000r／min 离 心10min；取上清至新的2mL PE 管中，并加入1mL－20℃预冷的无水乙醇；用枪头（已灭菌）挑取析出的DNA 至1.5mL PE 管中，并用70%的乙醇洗2遍，室温晾干；加50μL ddH2O，置于4℃冰箱过夜。用GeneQuant1300分光光度计检测DNA 的质量和浓度，ddH2O 将DNA 样品浓度稀释至50ng／μL作为标准样品，－20℃保存备用。

用于纯度鉴定的DNA（微量提取）：取金玉818种子500粒于25℃恒温培养箱中培养7d。待玉米长到4叶一芯时，用0.5mL PE管盖取叶片，加入3颗不锈钢珠，加入100μL65℃预热好的2%CTAB（含1%β－me），放研磨机上研磨；置65℃烘箱中30min，其间上下颠倒2次，取出冷却至室温；加入等体积的（100μL）氯仿∶异戊醇（24∶1），上下颠倒10min，置冷冻离心机上3 000r／min离心10min；分别取上清至PCR 板上，加等体积－20℃预冷的无水乙醇，静置10min沉淀DNA，短暂离心，弃乙醇，用70%乙醇洗涤DNA，3 000r／min离心10min，弃乙醇，自然晾干；加200μL ddH2O，4℃保存备用。3次重复，每次随机取样100个单位作为鉴定样品。

1.3 SSR分析

扩增反应在DNA－Engine（美国BIO－RAD公司生产）扩增仪上进行。

PCR 反应体系：ddH2O 4.6μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol／L Mg2＋1μL，2.5 mmol／L dNTP 0.2μL，5 U／μL TagDNA 聚 合 酶0.2 μL，5μmol／LSSR 引物（F＋R）2μL，50ng／μL DNA 1μL。

PCR 反应程序：94℃5 min，1 次循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，进行35次循环；终延伸：72℃10min，形成的扩增产物于4℃保存。

电泳检测：用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离SSR 扩增产物。固定：5%冰醋酸＋10%无水乙醇，蒸馏水洗2次；银染：0.15%硝酸银银染，蒸馏水洗2次；显影：1.5%氢氧化钠＋1 mL 甲醛溶液（2 块胶），蒸馏水洗2次；照相，获得杂交种和亲本的指纹图谱。

1.4 指纹图谱构建

筛选多态性好、清晰稳定的引物构建金玉818指纹图谱，并对指纹图谱进行数字化，在相同的迁移位置上（相同的分子量片段）无带记为0，有带记为1，建立数据库。参考文献[17－18]，计算出现相同指纹图谱的概率，计算公式为P＝1／2n，式中n为等位基因的数目，2为同一迁移率位点上的等位基因存在“有”、“无”2种关系。

1.5 种子纯度鉴定

根据构建的指纹图谱，从筛选出适用于金玉818纯度鉴定的引物中任选3对对供试金玉818进行纯度鉴定验证。

种子纯度＝[（供检测品种种子样本带型数－杂种种子样本带型数）／供检测品种种子样本带型数]×100%。

2 结果与分析

2.1 金玉818的指纹图谱构建

2.1.1 SSR 引物分析 40对标准SSR 引物对金玉818及其亲本进行同源性位点扩增和电泳检测，共检测到87个等位基因位点，每对引物检测出1～5个，平均2.42个（表1）。绝大多数引物在供试自交系中扩增出1条片段，但部分引物在某些自交系中扩增出2条或更多条带，这可能与基因组内存在多个与引物结合的靶位点等因素有关[19]。40对引物中未扩增出电泳带谱的引物4对，扩增成功的引物36对，双亲间没有多态性的引物11对，表现多态性的引物有25 对，多态性频率检出率较高（62.5%）。多拷贝引物、差异带为弱带或差异不易分辨的引物5 对，杂交种偏母本型引物有4 对（umc2105k3，umc2115k3，umcl23lk4，bnlg490y4），偏父本型的引物为umc2007y4，能够清晰、稳定、准确地鉴别出金玉818及其亲本且双亲呈互补带型的引物有15 对（umc1335y5，phi053k2，bnlg2305k4，bnlg16lk8，umc1545y2，umc1125y3，bnlg240kl，phi080k15，umc1147y4，umc1429y7，phi299852y2，umc2160k3，umc2084w2，umc1936k4，bnlg2235y5）。

2.1.2 指纹图谱构建 选择25 对具有多样性的引物，构建金玉818指纹图谱，共检测出68个等位基因，每一对引物可以检测到2～5个数目不等的等位基因。能作为检测金玉818品种真实性和纯度的引物有15 对，频率为37.5%。图1 为部分引物（phi053k2，bnlg2305k4，bnlg16lk8，umc1545y2，umc1125y3，bnlg240kl，umc1147y4，bnlg490y4）的扩增结果，扩增片段和农业部提供的参照样品的扩增片段大小一致。这15对引物中片段大小在100～200bp有6对（bnlg16lk8，umc1125y3，umc1147y4，umc1429y7，umc1936k4，bnlg2235y5）；在200～300 bp 有8 对 （umc1335y5，bnlg2305k4，umc1545y2，bnlg240kl，phi080k15，phi299852y2，umc2160k3，umc2084w2）；在 300 ～400 bp 仅 有 1 对（phi053k2）。

表1 玉米SSR40对标准引物的名称、序列及SSR 检测的等位基因数Table 1 The name and sequence of 40primers and the number of alleles detected by SSR

图1 部分引物对金玉818及其亲本的PCR 扩增产物电泳图谱Fig.1 Partial PCR amplification product electrophoresis of hybrid Jinyu818and its parents identified by SSR primers

bnlg16lk8、umc1125y3和umc1429y7均扩增出2条条带（父本、母本只有1条特异性条带），清晰、稳定、片段间分子量差距较大，片段大小在100～200 bp；phi053k2扩增出2条条带（父本、母本均只有1条特异性条带），虽然扩增片段大小在300～400 bp，但条带清晰、稳定、片段间分子量差距较大、特异性强、易于读带；umc1147y4虽然有4条条带（父本、母本均有2条特异性条带），但片段大小在100～200bp，且清晰、稳定、片段间分子量差距较大、特异性强、易于读带；bnlg2305k4 扩增出2 条条带（父本、母本均只有1条特异性条带），片段大小为100～200bp，且清晰、稳定、特异性强。综合考虑引物扩增片段的数量、片段大小及片段间分子量差异大小等 因 素，bnlg16lk8、umc1125y3、umc1429y7、phi053k2、umc1147y4和bnlg2305k4可作为鉴定金玉818真实性和纯度的最佳引物。

2.1.3 指纹图谱数字化 将25 对引物扩增片段数字化，使金玉818及其亲本的指纹图谱均用相应的数字表示。由表2 可知，QB506 分别由68 位顺序不同的数字码组成，出现与其完全相同数字的概率为3.39×10－21（P＝1／268），即在2.95×1020（268）份自交系中，只有1份自交系具有上述指纹号码相同。理论上利用这25对核心引物构建玉米自交系指纹图谱文库是完全可行的。因此，用这25对SSR引物构建指纹图谱，表2 中指纹号码是自交系QB506、T32和杂交种金玉818特有的号码，它们构成其相应的标准的数字化指纹图谱，可以用于鉴定其真伪。

表2 金玉818及其亲本的数字化指纹图谱Table 2 The digitization fingerprinting of hybrid Jinyu818and its parents

2.2 种子纯度鉴定

可用于金玉818纯度鉴定的引物有15对，从中任意选择3对（phi053k2，bnlg16lk8，umc1429y7）引物对供试金玉818 纯度进行鉴定。phi053k2、bnlg16lk8和umc1429y7检测供试金玉818种子纯度分别为92.5%、92%和93.5%，平均为92.5%，这些引物纯度鉴定结果吻合度高，说明，筛选出的引物应用于金玉818的纯度鉴定较为可靠。

从 图2 看 出，引 物phi053k2、bnlg16lk8 和umc1429y7对1～30 号DNA 的PCR 扩增产物的电泳检测结果，条带清晰，扩增效果较好。phi053k2检测发现，2号、11号、26号和29号DNA 的条带与F1DNA 的条带不同，并且这4个DNA 条带也各不相同；2号、11号和29号DNA 存在两条条带，其中一条与母本的特异性条带相同，另一条不同于母本、父本的特异性条带；26号DNA 的条带为偏父本型。phi053k2可以检测出这4 个DNA 的差异，说明phi053k2灵敏度较高。bnlg16lk8检测结果表明，2号、11号和29号DNA 的条带与F1DNA 的条带不同，且都含有母本特异性条带，29号为偏母本型。umc1429y7与bnlg16lk8检测结果一致。这3对引物检测2号、11号和29号DNA 的条带与F1DNA条带不同，均含有母本特异性条带，而另一条不同于母本、父本的特异性条带，说明，2号、11号和29号植株很可能在制种过程中有其他花粉混杂。phi053k2检测出26 号DNA 的条带为偏父本型，bnlg16lk8 和umc1429y7 检 测 出26 号DNA 的 与F1没有差别，说明26号植株为杂株。

图2 phi053k2、bnlg16lk8和umc1429y7对1～30号DNA的PCR 扩增产物电泳检测结果Fig.2 The PCR amplification product electrophoresis of No.1～30DNA identified by SSR primers phi053k2，bnlg16lk8and umc1429y7

3 结论与讨论

1）研究从40对国家标准SSR 引物中筛选25对多态性好、清晰、稳定的引物构建金玉818指纹图谱，共检测出68个等位基因，每一对引物可以检测到2～5个数目不等的等位基因，并进行数字化，出现与所获相同指纹图谱的概率为3.39×10－21，理论上利用这些引物构建金玉818及其亲本的指纹图谱是可行的。研究所获相同指纹图谱的概率高于吴渝生等[17]的研究结果（6.3×10－30），低于赵久然等[8]的研究结果。这不仅与供试材料、引物的数量、多态性程度有关，而且与选择的计算方法有关。吴渝生等运用的概率计算公式为P＝1／2n（n为等位基因数目），而赵久然等运用的概率计算公式为P＝1／N（自交系N＝n，杂交种N＝Cn1＋Cn2，n为所用引物的等位基因数）。目前，从理论上计算所获图谱出现概率的研究相对较少，应用较多的主要是以上2种计算方式。赵久然等认为，利用P＝1／2n计算出现相同图谱概率偏低，而P＝1／N 公式更接近玉米指纹图谱的真实情况。实际上生物个体的SSR 指纹图谱是由不同位点上的、不同类型的等位基因组合而成。等位基因的表型是通过同一个位点上扩增、电泳的条带的有、无及数量而确定的。玉米品种间具有的多态性条带数目越多，建立的指纹图谱就越准确[20－21]。P＝1／2n和P＝1／N 计算出现相同图谱概率值主要取决于等位基因数，当等位基因达到一定数目时，上述两个公式计算出现与之完全相同的另一张图谱的概率微小，所建图谱表现出该品种特异性。因此，P＝1／2n和P＝1／N 均可为玉米品种真伪鉴定的提供依据。从统计学理论角度考虑，吴渝生等所用的公式P＝1／2n计算出现相同图谱概率更为恰当。因此，本研究参考吴渝生等的计算方法。

2）指纹图谱构建显示，15 对引物适用于金玉818品种真实性和纯度鉴定，最佳引物是bnlg16lk8、umc1125y3、umc1429y7、phi053k2、umc1147y4 和bnlg2305k4。从15 对候选引物中随机选择phi053k2、bnlg16lk8 和umc1429y7 检测废弃 金玉818种子纯度，其结果分别为92.5%、92% 和93.5%，平均92.5%，表明，所选引物纯度鉴定结果吻合度高，应用于金玉818的纯度鉴定较为可靠。

3）研究在纯度鉴定技术中采用微量提取DNA的方法，恒温烘箱代替水浴锅温浴，与传统提取法相比，不仅节约称量和研磨所需时间，而且提取的DNA 质量较好，浓度较一致，能大大加快实验进程。所构建的指纹图谱用于金玉818鉴定是可行的，引物筛选和方法的改进为快速、准确的鉴定其真实性和纯度提供依据，对今后优化金玉818种子生产环节、规范种子市场和保障企业和农民的合法权益具有重要意义。

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