西藏牦牛mtDNA ATP8全序列测定及遗传多样性分析

2015-07-01柴志欣姬秋梅张成福信金伟宋乔乔钟金城

河南农业大学学报 2015年3期

关键词：帕里类群核苷酸

杨琴，柴志欣，姬秋梅，张成福，信金伟，宋乔乔，钟金城

(1.西南民族大学，四川成都 610041；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850000)

西藏牦牛mtDNAATP8全序列测定及遗传多样性分析

杨琴1，柴志欣1，姬秋梅2，张成福2，信金伟2，宋乔乔1，钟金城1

(1.西南民族大学，四川成都 610041；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850000)

对西藏16 个牦牛类群共367 头个体的mtDNAATP8(Adenosine Triphosphate 8)基因进行克隆及序列分析。结果表明，西藏牦牛mtDNAATP8基因全长201～203 bp，T、C、A和G 4种核苷酸的平均比例分别为29.3%、23.0%、41.8%和6.0%，A+T含量明显高于G+C，表现出一定的碱基偏倚性；在367 头牦牛中，共检测到19 个变异位点，其中单一信息位点15 个，简约信息位点4 个，存在转换和插入2 种变异类型，碱基替换中存在转换73 次，以A/G、T/C为主，占98.63%；在插入变异类型中以A碱基插入为主；367 头牦牛共捡出20 种单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性指数分别为0.332和0.001 89，说明西藏牦牛具有较贫乏的遗传多样性；聚类分析显示，西藏牦牛可分为2 类，其中桑日牦牛、类乌齐牦牛和桑日牦牛为1 类，其余牦牛类群为另1 类。20 种单倍型可以分为2 个聚类簇(I和Ⅱ)，其中聚类簇I包含17 种单倍型，占全部单倍型数的77.27%，包含了本次研究中的所有西藏牦牛类群；聚类簇Ⅱ中有3 种单倍型，囊括了除错那、嘉黎、康布和帕里类群外的12 个类群，显示西藏牦牛存在2 个母系起源。

西藏牦牛；线粒体DNA；58基因；遗传多样性

拥有“高原之舟”美称的牦牛(Bosgrunniens)是分布于海拔3 000 m的青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区的珍稀牛种，在长期的自然选择和人工选择作用下，不管是其形态结构还是生理功能都能很好地适应高寒、低氧以及强紫外辐射的环境。全世界现有牦牛1 420余万头，其中中国有1 330多万头，占牦牛总量的93.67%；西藏作为牦牛的主产区之一，现有牦牛492.3 万头，占中国牦牛总数的37%，位居全国第2[1，2]。牦牛能够为牧民提供肉、奶等生产、生活必需品，是当地畜牧业经济中不可缺少的畜种，在遗传上是一个极为宝贵的基因库。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态多样性和物种多样性的基础。动物线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)因具有母系遗传、多态性丰富、结构简单等特点，被认为是研究物种起源、演化和分类最好的分子遗传标记[3]。国内学者张成福、赵上娟、姬秋梅和姜雪鸥等[4-7]通过测定西藏11个牦牛类群的D-loop区、COⅢ、Cytb、12SrRNA基因的核苷酸序列对西藏牦牛的遗传多样性、类群间的亲缘关系和系统进化关系进行了研究。但利用ATP8基因对西藏牦牛的遗传多样性及其类群间的系统进化关系研究尚属空白。哺乳动物编码ATP合成酶F0亚基部分结构的ATP8基因位于线粒体基因组上，是线粒体内膜呼吸链基因的重要成员之一[8,9]。本研究以西藏16个牦牛类群为研究对象，通过测定mtDNAATP8全基因序列，探讨牦牛遗传多样性及其类群间的亲缘关系，以期为进一步的保护牦牛遗传资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从16 个西藏牦牛类群中，选取健康成年的牦牛367头(表1)，采集其耳组织，用体积分数75%的乙醇保存带回实验室，存于-20 ℃的冰箱中备用。

1.2 基因组DNA的提取及检测

运用动物组织基因组提取试剂盒(TianGen生物技术公司)提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的纯度和浓度，-20 ℃保存备用。

1.3 引物设计与序列扩增

根据GenBank中公布的牦牛ATPase8基因的核苷酸序列(GenBank:AY684273.2)，用Primer Premier 5.0设计1对引物，引物序列为：F：GTTAGAGATTGAGAGCAGTATGCT；R：AAACCACATGGCTAAGCCGG，由英潍捷基(上海)生物科技有限公司合成。

PCR反应体系为25 μL；其中，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×long Taq DNA预混酶12.50 μL(0.625 U)，无菌ddH2O 9.50 μL。

PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

1.4 目的基因克隆测序

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小，然后用DNA胶回收试剂盒(TianGen)进行分离纯化，再连接到pMDTM19-T载体(TaKaRa公司)上，并转化到高效感受态细胞DH5α中，LB平板培养基(含有2%X-Gal，1%IPTG和1%Amp)上37 ℃培养12～16 h，筛选阳性克隆在700 μL LB液体培养基(含1%Amp)中37 ℃振荡培养6～7 h。重组子经菌液PCR鉴定后，用ABI3730XL型DNA测序仪进行正反双向测序。

1.5 数据处理

用DNAMAN 5.2.2软件对所测序列进行拼接，比对并进行人工校对；用MEGA5.05软件统计序列的长度、碱基组成、氨基酸组成，以及计算类群间的Kimura双参数距离并以邻接法(Neighbor-Joining，NJ) 构建品种间聚类关系；用DnaSP5.10软件进行变异位点、核苷酸多样性以及单倍型多样性分析；用Network4.6.1.1(http://www. fluxus-engineering.com/sharenet.htm)构建单倍型网络关系图。

2 结果与分析

2.1 西藏牦牛mtDNAATP8基因的核苷酸和氨基酸组成

表1 供试牦牛类群、数量及采样地点

经测序得到西藏16 个牦牛类群367 个个体的ATP8基因全序列，基因全长201～203 bp，起始密码子为AUG(ATG)，终止密码子为UAA(TAA)，编码66个氨基酸。T，C，A和G 4种核苷酸的平均比例分别为29.3%、23.0%、41.8%和6.0%；A+T 含量71.1%，G+C 含量29.0%，表明西藏牦牛ATP8基因具有明显的碱基偏倚性，这与线粒体蛋白编码基因的典型特征相符。根据脊椎动物线粒体中密码子编码规律[10]，统计发现：ATP8基因所编码各氨基酸平均含量差异较大，不含半胱氨酸(Cys)、精氨酸(Arg)和缬氨酸(Val)，而亮氨酸和丝氨酸的平均含量较高，分别为15.64%和11.31%。

2.2 西藏牦牛ATP8基因的遗传多样性

在367 头牦牛中，全序列共有19 个可变位点，其中单一信息位点(Singleton variable sites)15 个，简约信息位点(Parsimony informative sites)4 个。所测序列与下载的参考序列(GenBank：AY684273.2)进行比对，发现存在转换和插入2 种变异类型，其中转换74 次，以A->G，T->C为主，占98.64%；存在4 个插入位点(SS5：2223；DQ38：3031；DQ46，SS5：75 76；BQ1，JD2：196197)。西藏牦牛ATP8基因核苷酸多样性为0.001 91(表2)。在16 个西藏牦牛类群中，桑桑和斯布牦牛的核苷酸多样性较高，分别为0.004 33和0.003 00。而康布、帕里和嘉黎牦牛的核苷酸多样性最低均为0.0000。对所有突变点进行Tajima’s中性检验，Tajima’s D值为-2.195 93，P<0.01，差异显著，进化方式不平衡，为负向选择，说明西藏牦牛可能出现了群体扩张模式。