玉米雄穗结实基因Ts9的初步定位

张赛赛，席章营，安云权，李明娜，谢慧玲，张莹莹，崔新建，陈彦惠，吴连成

(河南农业大学农学院， 河南 郑州 450002)



玉米雄穗结实基因Ts9的初步定位

张赛赛，席章营，安云权，李明娜，谢慧玲，张莹莹，崔新建，陈彦惠，吴连成

(河南农业大学农学院， 河南 郑州 450002)

利用具有Mu9转座子的材料和豫82杂交，从M2分离群体中得到1株雄穗结实突变株，表现型为雄穗上的雄花中雄蕊发育受到抑制，雌蕊不发生退化，雄花转化为雌花。遗传分析表明，该突变性状受1对显性基因控制，初步命名为Ts9。以玉米自交系B 73与突变体材料杂交构建BC1分离群体，利用SSR标记将Ts9定位在第1染色体的1.09 bin区域，位于SSR标记umc2047和umc1431之间，距这2个标记之间遗传距离分别为4.2和2.0 cM。

玉米；雄穗结实；遗传分析；基因定位

玉米是通过败育雄穗中的雌蕊和抑制雌穗中雄蕊进而形成功能性单性花[1]。雌、雄穗的分化与形成是个连续的过程。根据变化过程中形态发育特点可分为生长锥未伸长期、生长锥伸长期、小穗分化期、小花分化期、性器官发育形成期等5个时期。在性别决定程序启动之前雌、雄花序的发育几乎是相同的,早期的雌性和雄性小花都具有相同的花器官原基,包括外稃和内稃、1对浆片、3枚雄蕊原基和由3片心皮聚合成的1枚雌蕊原基。在小花分化期，正常发育的雄花会在小花基部形成3个雄蕊原始体，中间形成1个雌蕊原始体，称为雌雄蕊形成期，随后雄蕊继续发育产生药隔，雌蕊原始体便逐渐退化。

在玉米的性别决定过程中，根据不同功能基因突变产生的表现型将相关的突变体分为2类：雄性化突变体和雌性化突变体[2]。玉米雄穗小花性别反转的异常株系称为tassel seed(ts)突变体，共有的表现型特征是具雄穗结实(tassel seed)现象[3]。1955年，NICKERSON等[4]详细描述了8种雄穗结实突变体(ts1～ts8)的表型，其中ts1，ts2，ts4，ts8为隐性基因，Ts3，Ts5，Ts6为显性基因，ts7的研究仅限于表现型的描述。在ts1突变体中，雄花完全转换为雌花，雌穗中子粒排列杂乱。ts1基因被定位在第2染色体短臂bin 2.04区域，编码脂氧化酶，并影响植物激素茉莉酸的生物合成，阻止雌蕊正常退化过程而形成有功能的雌蕊[5]。ts2突变体的表现型类似ts1，被定位在第1染色体的bin 1.03区域，已被DELONG等[6]克隆出来。ts2基因编码一个短链乙醇脱氢酶，ts2功能的丧失阻止了玉米植株中雄穗和雌穗中雌蕊的败育，可能是产生雌蕊细胞凋亡的信号或者代谢一种细胞生活力的底物[7]。ts1和ts2也影响了雌穗中雌蕊的发育，次级小花器官退化受阻，结实小穗中产生功能正常的2个雌花，经授粉后形成双种子，使谷粒拥挤且排列不规则[8]。ts4的突变体表现为雄穗直立，有大量花丝，花序内有大量不规则分支，结实子粒排列无规则。ts4基因被定位在第3染色体bin 3.04区域，编码一个mir 172的microRNA，靶定APETALA2同源异型转录因子，不仅促进雄花的发育，还调控小穗分生组织的分化[9]。Ts6的突变体性状与ts4的类似，Ts6基因被定位在第1染色体bin 1.11区域，编码一个类似于APETALA2的转录因子，它是TS4的一个靶位点[10]。Ts6和ts4突变体共有的特征是花序中小穗分支增加以及每个小穗产生多个小花[11]。ts8基因是si1的1个等位基因，位于第6染色体bin 6.02区域，突变性状为雄性不育且长有花丝，雌穗生长有大量增生的花丝[12]。Ts5基因位于第4染色体bin 4.03区域，突变体表现为雄穗直立紧凑，有分支，附着的花丝较短，大多数雄穗分支基部有雌花生成，雄穗上有很少的子粒形成[13]，也有研究称该突变基因为半显性[14]。Ts3的雄穗上由雄花和雌花间隔排列，雌穗中次级小花发育正常，被定位在第1染色体bin 1.09区域[15]。近年来，对已发现的8个玉米雄穗雌性化突变体中部分基因进行了克隆和功能研究，深化了人们对玉米性别决定过程的认识。但玉米性别决定调控途径中有哪些基因以及这些基因是如何相互作用等还有待深入研究。本研究前期利用Mu9作为mutator转座子供体材料，以优良玉米自交系豫82为受体材料，并从其后代中得到一个雄穗结实突变体，初步将其命名为ts9。该突变体表现为雄穗中的雄蕊发育受到抑制，雌蕊不发生退化，雄穗长有大量花丝，完全转化为雌花。为此，针对该突变性状进行了表现型特征和遗传规律的研究，利用SSR分子标记对突变体雄穗结实性状进行了初步的基因定位，以期为该基因的克隆、功能分析及玉米性别分化的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含Mu9活性转座子的玉米材料由中国农业大学赖锦盛教授馈赠；豫82是河南农业大学选育的具有紧凑株型、良好抗病性以及很强适应性的优良玉米自交系。2011年夏用含Mu9转座子的玉米材料作父本与豫82杂交，随后通过自交获得M2分离群体，观察鉴定得到雄穗结实突变株Ts9，并从2011冬开始通过回交产生了具有Mu9转座子的豫82近等基因系。

1.2 定位群体的构建及表型特征观察

2013年夏用雄穗结实突变株做母本，自交系B 73为父本，杂交获得F1，2013年冬从F1中选雄穗结实突变株做母本，B 73做父本，构建BC1分离群体。2014年夏通过BC1分离群体对突变体进行表型鉴定与基因定位。在玉米小花分化期，取正常植株和突变体的雌穗和雄穗，将所取样品用4%戊二醛固定，用于扫描电镜观察其穗分化；在抽雄期调查分离群体中的突变个体数和正常个体数，用χ2测验确定其分离比例。

1.3 基因组DNA提取及基因的初定位

2014年夏天，在玉米5～6片叶时采用CTAB法提取BC1分离群体中单株叶片的基因组DNA，并选取10株雄穗结实突变单株的DNA和10株表型正常单株的DNA，等量混合后，分别构建 “突变池”和“对照池”。利用玉米基因组数据库选择的均匀覆盖10条染色体的535对SSR引物，采用分离群体分组分析法(Bulked segregant analysis, BSA)[18]进行多态性标记筛选，利用与目标基因连锁的SSR标记对基因进行初步定位。

1.4 突变基因的遗传连锁分析

将母本突变体材料基因型记为Aa，带型记为3，父本B 73基因型记为aa，带型记为1，缺失的单株记为0。利用Mapmaker 3.0对结果进行统计分析，计算连锁标记之间的遗传距离[16]，用MapDrawV 2.1绘制目标基因组区段的染色体连锁图[17,18]。

2 结果与分析

2.1 分离群体中雄穗结实突变株的表型特征

田间性状调查显示，在分离群体中，突变体株高与正常植株株高基本一致，突变个体在抽雄前植株顶端膨大变粗，包裹顶端雄穗的叶鞘变宽变长，与雌穗的苞叶类似，叶色较正常，植株略浓绿。雄穗抽出后，雄性小花完全转变为功能性雌性小花，整个雄穗被花丝覆盖；突变体的雄穗分枝数与正常植株相比变化不大，且紧紧围绕主轴排列(图1-A,B)。个别单株在雄穗顶端有成熟的雄花出现，并能产生可育花粉；植株较弱时需及时去顶端雌性化的雄穗后才能长出正常的雌穗；植株健壮时，上端的雌性化雄穗和植株中部的雌穗均能正常发育。突变材料的雄穗和雌穗在接受花粉时均可正常结实，无双种子产生，子粒排列规则(图1-C)。电镜观察显示，突变体雄穗的雄花在小花分化期的初级小花雌蕊发育正常，而3个雄蕊的发育受到抑制(图1-D)；在性器官形成期，突变体雄穗的雄花的雌蕊原基迅速增大，形成胚珠(图1-E)。

A， B，C：突变株的雄穗； D，E：电镜下突变株的雄穗；og-花颖，p-雌蕊，s-雄蕊，si-花丝，op-胚珠。

A,B,C: Tassel with feminized florets, as shown by presence of silks； D,E:SEM of the tassel of theTs9 mutant; og： the outer glume, p： the pistil primordial, s： stamen; si： silk; op： a single ovule primordium.

图1 玉米突变体的形态特征

Fig.1 Phenotype of the maize mutants

2.2 雄穗结实突变基因的遗传分析

由于绝大多数突变体不能产生花粉，不能产生纯合的突变材料，2013年夏利用突变株做母本与B 73杂交，其F1群体发生性状分离，雄穗结实突变体株数与正常植株株数分别为125和137株，符合1∶1的分离比例，初步表明，该突变基因为显性。2013年冬利用F1群体中的突变体为母本，与玉米自交系B 73回交，获得其BC1种子。2014年在河南农业大学郑州科教园区将突变体与B 73所组配的BC1分离群体进行田间表型性状调查，其突变株数和正常株数分别为346株和368株，χ2检验表明，群体中的突变单株与非突变单株的分离为1∶1(表1)，符合单基因控制的性状分离规律，说明该突变性状是受1对显性基因控制。同时，因该突变体的表现型与已知的8个单基因雄穗结实ts突变体的表型不同，所以，初步将其命名为ts9。

表1 玉米突变体分离群体的χ2检测

2.3 雄穗结实突变基因的初步定位

将均匀分布于10条染色体上的535对SSR引物在B 73和做母本的突变单株间扩增，共筛选出30对在两亲本间多态性比较好的引物，然后，用这些引物分别在两基因池间进行多态性分析，筛选到16对多态性引物。用在两池间有多态的SSR标记在BC1代群体中各单株间进行PCR扩增，发现位于第1染色体上bin1.08～1.09的5对SSR标记phi423298，bnlg2228，umc2047，umc2612，umc1431与突变基因连锁。经连锁分析，将目的基因Ts9初步定为在SSR分子标记umc2047和umc431之间，两标记之间遗传距离为6.2 cM，其物理距离约为10 Mb。Ts9距SSR标记umc2047的遗传距离为4.2 cM，距umc1431的遗传距离为2.0 cM(图2)。

图2 玉米雄穗结实突变体基因Ts9在染色体上的位置

3 讨论

本研究由前期构建的Mu转座子M2分离群体中筛选到1个与玉米性别决定有关的雄穗结实突变体，该突变体雄穗中小花在小花原基形成小花的过程中，初级小花的3个雄蕊并没有生成药隔，雌蕊原始体也没有逐渐退化，反而是雌蕊原基迅速增大形成胚珠，3个雄蕊的发育受到抑制，雌蕊的发育完全正常，最终形成可育的雌花，抽雄后整个雄穗长满花丝。但在田间调查(Ts9×B 73)×B 73群体的表现型时发现，在346个突变单株中有8株突变体的雄穗中上部有发育正常的雄花且能正常散粉结实，并有部分小花形成了1个花药或2个花药。其具体原因是遗传背景、基因回复突变，还是环境问题，有待进一步研究。

在已报道的显性雄穗结实突变体中，已知的定位结果显示，Ts3和Ts6分别位于1号染色体的bin1.09和bin1.11区域[11,15]。Ts3突变体雄穗中被一些不育的雌花隔开，常形成一个环，而不是成行排列，在顶部形成不育的雌蕊，而且雌穗中次级小花发育[18]。Ts6的典型特征是雌穗和雄穗均有增殖的分枝[11]。本研究发现的Ts9突变体表现为雄穗分支与正常分枝类似，但整个雄穗中小花都完全雌性化，能授粉结子，且雌雄穗的子粒排列规则，次级小花不能发育，与Ts6表型差异较大，并且定位区间不同，故与Ts6是不同的基因。PHIPPS[15]在1928年首次提到的ts3，EMERSON对其进行了详细的表型描述并将其定位在第1染色体[19]；从玉米基因组数据库中了解到，最原始的材料已丢失，现有的Ts3材料是由DOONER发现的，表现型与EMERSON的描述类似，定位在bin1.09区域。本研究将该显性突变基因初步定位在第1染色体上的bin1.09区域，包含距离Ts3最近的2个分子标记TIDP6329和 IDP7685，物理距离约为5 Mb。Ts9与Ts3虽然同在bin1.09区域，但定位区间较大，而且两者的表型不完全一致，又都没有精细定位和功能研究，是否为同一基因或紧密连锁的基因，还有待于进一步验证。

本研究发现并研究了与玉米性别决定有关的Ts9突变体。该突变体表型为雄穗上雄性小花转化为雌性小花，并能正常结实。电镜观察得知，是由于在小花分化期，雄穗花序中雄蕊发育受到抑制，而雌蕊不退化造成的。遗传分析及初定位表明，Ts9是受1对显性基因控制，接下来将利用构建的分离群体进一步对Ts9基因进行精细定位、克隆和功能研究，以期为探究玉米性别决定和进化机制提供依据，为玉米性别决定在高产育种的应用做出一定的贡献。

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(责任编辑：常思敏)

Initial genetic mapping of a tassel seed geneTs9 in maize

ZHANG Saisai, XI Zhangying, AN Yunquan, LI Mingna, XIE Huiling, ZHANG Yingying,CUI Xinjian, CHEN Yanhui, WU Liancheng

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

From a Mutator inserted M2segregating population constructed by a cross between Mu9 and Yu 82, a tassel seed mutant was isolated, which shows that the pistil in male flowers on the tassel is not degraded. This makes stamen development restrained and leads to a transformation of tassel florets from stamination to pistillation. The genetic analysis indicated that the mutant trait was controlled by a single dominant gene, designated asTs9 (tasselseed9)．In addition，by using SSR markers and BC1segregating population derived from the cross between the maize inbreds B 73 and the mutant, theTs9 gene was mapped between umc2047 and umc1431, with the genetic distance of 4.2 cM and 0.8 cM at 1.09 bin of chromosome 1.

maize (ZeaMayL.); tassel seed; genetic analysis; gene mapping

2014-12-13

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012AA10A300)；河南省科技攻关项目(122102110039)

张赛赛(1988-)，女，河南沈丘人，硕士研究生，主要从事玉米遗传育种研究。

吴连成(1971-)，男，河南确山人，硕士研究生导师。

1000-2340(2015)03-0301-04

S 513

A