河南铁棍山药的染色体数目及核型分析

周翼虎,霍秀文,刘向宇,邰丽华,苗慧琴,张灵超

(1.内蒙古农业大学农学院,内蒙古 呼和浩特010019; 2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特010022)



河南铁棍山药的染色体数目及核型分析

周翼虎1,霍秀文1,刘向宇1,邰丽华2,苗慧琴1,张灵超1

(1.内蒙古农业大学农学院,内蒙古 呼和浩特010019; 2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特010022)

以根尖为材料采用酶解去壁低渗法，对河南铁棍山药(DioscoreaoppositaThunb.)染色体进行制片、计数，并进行了核型分析。结果表明，河南铁棍山药的染色体数目为120；核型公式为2n=120=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T，染色体相对长度组成为16 L+26M2+60M1+18 S。染色体的绝对长度范围0.688～2.628 μm，为微小型染色体或小型染色体。相对长度范围为0.869%～3.319%。核型不对称系数为58.13%。最长染色体长度是最短染色体长度的3.819倍，臂比大于2∶1的比例为11.67%，核型类别属于2B型，系统演化上属于较原始的植物。

山药；染色体数目；核型分析

山药为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)薯蓣(D.oppositaThunb.)的俗称，主要分布于中国，周边国家也有少量分布，英文俗名为Chinese yam；缠绕性藤本植物，雌雄异株；其块茎既是一种营养丰富的蔬菜，又是滋补的上等药材。在中国种质资源丰富，从东北到广西均有分布，北方温带地区普遍栽培。在众多地方栽培品种中，河南怀山药的药用价值最高，药典中言其“补中益气，温养肌肉”“益肾气，健脾胃”[1-3]，现代医学报道其含有“抗氧化、抗衰老、抗肿瘤”“降血糖、降血脂”的成分[2,3]，以古怀庆府一带(今河南省焦作市沁河两岸)所产的怀山药为道地药材，在怀山药中又以铁棍山药品质最好。河南铁棍山药是山药中的精品，是受国家保护的地理标志产品[4]，是重要的种质资源。染色体是遗传物质的载体，植物染色体数目和核型是植物相对稳定的物种特征，对研究植物演化、资源评价、远缘杂交、育种工作都具有重要意义[5]。国内外对薯蓣属植物的栽培、成分分析、离体培养等方面已有了广泛的研究。近年来，随着对该属植物的深入研究，染色体倍性方面及分子遗传学方面的研究也渐热。但关于山药(D.oppositaThunb.)染色体方面的报道较少，尤其是对河南铁棍山药这一品种的染色体研究未见报道。为此，本研究对河南铁棍山药染色体进行了染色体数目及核型分析，旨在为薯蓣属植物品种亲缘关系鉴定、种质创新及利用、新品种培育等提供细胞学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的2份山药材料分别为2012年引种的河南铁棍山药块茎(HNTGH 39)和2013年引种的河南铁棍山药零余子(LYZ 60)，皆引自于河南温县，种植于内蒙古农业大学山药种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 染色体标本制备 在山药生长旺盛时期，浇水后次日上午9:00—10:00取不同个体的幼嫩白色根尖。用自来水冲洗，剪取根尖材料，置于预处理液中，14 ℃处理1 h；预处理液为0.002 mol·L-1的8-羟基喹啉溶液与0.05 g·L-1的秋水仙素溶液等量混合液。用蒸馏水冲洗后放入卡诺固定液[V(无水乙醇)∶V(冰乙酸) =3∶1]中4 ℃固定24 h。将根尖冲洗后置于0.075 mol·L-1氯化钾溶液中，室温低渗处理30 min。冲洗，置于0.25 mol·L-1的盐酸溶液37 ℃水浴12 min。冲洗10 min后用酶解液37 ℃水浴18 min，酶解液中纤维素酶(Cellulose Onozuka R-10)的质量分数为3%，果胶酶(Pectolyase Y-23)质量分数为0.1%。蒸馏水中进行后低渗处理30 min以上，切取分生区，用镊子尖将材料稍压分散，滴改良品红染液染色2 min。盖上盖玻片后用解剖针尖轻敲，使细胞温和地逐步分散后用拇指轻压。

1.2.2 核型分析 用OLYMPUS BX 51显微镜观察染色体制片，在100×物镜下对染色体充分分散的中期分裂细胞进行拍照。对河南铁棍山药材料取40个中期分裂相细胞进行染色体计数。选择背景清晰、染色体形态清晰的5个细胞进行染色体长度的测量，用于核型分析。图像采集和指标测量均使用奥特光学显微图像处理系统OPTPro 2008 v 2.0完成。按染色体形态大小和着丝粒位置进行染色体配对，并根据染色体臂长计算出染色体绝对长度、相对长度和臂比等核型参数。使用Karyo 3.1染色体分析软件进行染色体核型图的制作，运用Microsoft office Excel制作核型模式图。核型分析参照李懋学的标准[6]，核型分类依据Stebbins的标准划分[7]。根据LIMA-de-FARIA的染色体场理论[8]，绝对长度小于1 μm属于微小型染色体，绝对长度在1～4 μm属于小型染色体。核型不对称系数的计算按照ARANO的方法，即核型不对称系数=长臂总长/全组染色体总长[9]。着丝粒位置按照LEVAN的方法[6]划分，相对长度指数(index of relative length，IRL=染色体长度/全组染色体平均长度)，按照KUO[10]的方法计算并对染色体进行分类。凭证标本保存于内蒙古农业大学农学院蔬菜遗传育种实验室。

2 结果与分析

2.1 河南铁棍山药的染色体数目

对河南铁棍山药根尖有丝分裂中期细胞的观察统计结果表明，40个中期分裂相细胞中有35个细胞染色体数为120条，所占比例为87.5%。依照李懋学等[6]的标准，统计的细胞中85%以上具有恒定一致的染色体数，即可认为是该植物的染色体数目。综上所述，确定河南铁棍山药的体细胞染色体数目为2n=120。

2.2 染色体核型分析

河南铁棍山药材料的染色体中期分裂相图像和核型图见图1，核型模式图见图2，染色体的臂长、臂比等核型参数见表1。

河南铁棍山药核型公式为2n=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T。其中中部着丝粒染色体占到80%，亚端部着丝粒染色体有2对，端部着丝粒染色体有1对；有5对染色体有随体，分别为第1对、第3对、第5对、第6对、第7对染色体。染色体的绝对长度范围为0.688～2.628 μm，根据LIMA-dE-FARIA的染色体场理论[8]，属于微小型染色体或小型染色体，全组染色体绝对长度的全长为79.185 μm，均值为1.320 μm。相对长度范围为0.869%～3.319%。根据相对长度指数划分，河南铁棍山药的染色体组成为16 L+26M2+60M1+18 S。核型不对称系数=长臂总长/全组染色体总长，即得58.13%。最长染色体长度是最短染色体长度的3.819倍，臂比大于2∶1的比例为11.67%，核型不对称性属于2B型。

图1 河南铁棍山药中期染色体图及核型图

图2 河南铁棍山药的核型模式图

表1 河南铁棍山药染色体的核型参数

续表

注： 1，*：具随体染色体；m：中部着丝粒； sm：近中部着丝粒； st：近端部着丝粒； T：端部着丝粒； 2，随体长度计入染色体全长。

Note： 1.*: chromosome with satellite; m:median region; sm: submedian region; st: subterminal region; T: terminal point.2.the total length and arm ratio include the length of satellite.

3 讨论

河南铁棍山药在一定区域内栽培历史悠久，已经形成较为稳定的地方品种。怀山药2006年成为山药中首个国家地理标志产品。北纬34.48°～35.30°、东经112.02°～113.38°的地理范围，即焦作市的温县、武陟等县所产河南铁棍山药和另一当地品种为受国家保护的原产地产品[11]。本试验首次以该地方品种为研究对象，对其进行染色体数目的统计及核型分析。由于山药主要以无性繁殖的方式栽培，不同个体有可能为同一株系的后代，如果单一使用1份该地方品种材料进行统计，有可能造成对该地方品种染色体数目的错误概括。为了更准确报道河南铁棍山药的染色体数目，本试验对不同年份引种的2份河南铁棍山药材料进行染色体观察计数。结果表明，河南铁棍山药的体细胞染色体数目为2n=120。

薯蓣属植物花单性，雌雄异株，多数分布于在热带和亚热带，西非国家有多个种作为粮食作物栽培。在中国的地理分布较广，种类以云南高原地区最多[12]，主要有参薯(D.alata)和山药(D.oppositaThunb.)作为粮食作物栽培。许多种是多倍体，在自然进化或人工栽培的进程中，经历了极其复杂的变异过程[4]。薯蓣属栽培种由于长期营养繁殖导致多数可食用种不能产生花[13]，或者不可育，而且栽培种的倍性水平比野生种更复杂多样。这种现象与长期栽培、人工选择有关。国内外学者开展了对该属作物栽培生产体系中的种质之间的遗传进化关系研究。其中SCARCELLI等[14]通过对包括栽培种和野生种在内的213份该属植物种质材料进行AFLP分子标记分析，研究了贝宁共和国该属栽培种的遗传本质，在分子水平上证明了在传统栽培生产体系中人们对该属野生种的使用，也揭示了在这个过程中种间杂交、品种间杂交的发生。

薯蓣属许多种有多个染色体数。BAQUAR对尼日利亚9个种进行染色体计数，其中4个有多个染色体数，其他的5个种又有2个有不同染色体数目的报道[13]。秦慧贞等采自海南吊罗山、福建南靖、云南蒙自的黄独(D.bulbiferaL.)分别有40，60，80条染色体[4]；盾叶薯蓣(D.zingiberensis)有2n=20的野生种，也有2n=40的栽培品种[15]。山药(D.oppositaThunb.)染色体数目更多，它的染色体在薯蓣属已知染色体数目的种中数目最多[4]，长期以来，对其染色体数目有140，144，138～140等报道，最新的报道为144条[15]。本研究发现，山药有2n=120的品种，表明山药(D.oppositaThunb.)也有多个染色体数目。

一般认为，亚洲的薯蓣属植物以10为染色体基数[16]，那么，河南铁棍山药可能为12倍体。但近几年里因同工酶、SSR、流式细胞仪等先进技术的运用，SCARCELLI等[17]，GEMMA等[18],BOU-SALEM等[19]分别指出，薯蓣属的D.rotundata，D.trifida，D.alata染色体基数为x=20，否定了传统一直以来认为的基数为10的学说。2012年NEMORIN等通过对1份D.alata(2n=80)的子代分析了基于SSR标记的遗传模式，确定了其多倍体类型为同源四倍体[20]。按薯蓣属的染色体基数为x=20的理论，河南铁棍山药也可能为6倍体。至于是同源多倍体，还是异源多倍体有待进一步分析研究。

本试验核型分析观察到，河南铁棍山药具有5对带随体的染色体。黄贤兰等报道的来源于云南省的山药的核型公式为：2n=144=57 m+84 sm+3 st，核型类型为2 B型[15]。本试验中来源于河南焦作市的铁棍山药核型公式为：2n=120=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T，属2 B型。虽然染色体数目、核型公式不同，但核型不对称性同属于2 B型，均说明了薯蓣是在系统演化上处于比较原始的植物。对比STEBBINS[7]核型分类指标之一 “臂比大于2∶1的染色体百分比”，本试验材料的数值为11.67%，小于黄贤兰材料的29.16%；再有核型不对称系数为58.13%，也小于黄贤兰材料的63.95%[15]。可以看出河南铁棍山药的不对称性小于黄贤兰报道的云南山药的不对称性。一般认为，核型不对称的植物比核型对称的植物进化程度高。因此，河南铁棍山药比云南山药更为原始。相比自然变异多物种丰富的云南地区[12]，河南铁棍山药所处的环境更稳定，推测河南铁棍山药在相对稳定的自然环境中进化速度较缓慢。

[1] 宋爱新.薯蓣科植物——山药的研究[D].开封:河南大学,2002.

[2] 杨 明.山药种质资源的遗传多样性研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2011.

[3] 王 阳,霍秀文,周翼虎,等.不同品种山药块茎多糖和黏液质多糖对自由基清除能力的研究[J].辽宁大学学报：自然科学版，2012，39 (4): 354-360.

[4] 秦慧贞,张美珍,凌苹苹,等.中国薯蓣属细胞分类的研究——染色体数与该属起源和进化[J].植物分类学报，1985,23(1):11-18.

[5] 邰丽华,王铁娟,敖登花，等.六种蒿属沙生半灌木染色体核型分析[J].内蒙古师范大学学报：自然科学汉文版,2012,41(4): 420-427.

[6] 李懋学,陈瑞阳.关于植物核型分析的标准化问题[J].武汉植物学研究,1985,3(4):297-302.

[7] STEBBINS G L.Chromosome evolution in higher plants[M].London: Edward Arnold Ltd,1971: 72-123.

[8] LIMA-de-FARIA.Classification of genes,rearrangements and chromosomes according to the chromosome field [J].Hereditas,1980,93:1-46.

[9] ARANO H.Cytological studies in subfamily carduoideae (compositae) of Japan [J].Bot Mag,1963,76:32.

[10]KUO S R,WANG S R,HUANG T C.Karyotype analysis of some Formosan gymnosperm[J].Taiwania,1972,17 (1): 66-80.

[11]闫新福,李凯军,李小平,等.GB/T 20351—2006.地理标志产品怀山药[S].北京:中国标准出版社,2006.

[12]万金荣,丁志遵,秦慧贞.薯蓣科植物地理学的研究[J].西北植物学报,1994,14(2):128-135.

[13]BAQUAR S.R.Chromosome behavior in Nigerian yam(DIOSCOREA)[J].1980,54:1-9.

[14]SCARCELLI N,TOSTAIN S,MARIAC C,et al.Genetic nature of yams (Dioscoreasp.) Domesticated by farmers in benin (West Africa)[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2005,53 (1):121-130.

[15]黄贤兰,郭华春.4种薯蓣属植物的核型分析[J].云南农业大学学报，2012,27(1):7-13,28.

[16]裴 鉴,丁志遵.薯蓣科中国植物志 [M].第16卷.北京：科学出版社,1985:60-121.

[17]SCARCELLI N,DA NOU O,AGBANGLA C,et al.Segregation patterns of isozyme loci and microsatellite mar-kers show the diploidy of African yamDioscorearotundata(2n=40)[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,111(2):226-232.

[18]GEMMA A，NEMORIN A,MALEDON E,et al.Revision of ploidy status ofDioscoreaalataL.(Dioscoreaceae) by cytogenetic and microsatellite segregation analysis[J].Theoretical and Applied Genetics,2009,118(7):1239-1249.

[19]BOUSALEM M,ARNAU G,HOCHU I,et al.Microsate-llite segregation analysis and cytogenetic evidence for tetrasomic inheritance in the American yamDioscoreatrifidaand a new basic chromosome number in theDioscoreae[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,113(3): 439-451.

[20]NEMORIN A,ABRAHAM K,DAVID J,et al.Inheri-tance pattern of tetraploidDioscoreaalataand evidence of double reduction using microsatellite marker segregation analysis[J].Molecular Breeding,2012,30(4):1657-1667.

(责任编辑：常思敏)

Chromosome number and karyotype analysis of Henan Tiegun yam (DioscoreaoppositaThunb.)

ZHOU Yihu1, HUO Xiuwen1, LIU Xiangyu1, TAI Lihua2, MIAO Huiqin1, ZHANG Lingchao1

(1.College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019,China; 2.College of Life Science and Technology,Inner Mongolia Normal University,Hohhot 010022,China)

In this paper the chromosome number and karyotype of Henan Tiegun Yam (DioscoreaoppositaThunb.) were analyzed by the enzymatic hydrolysis and low osmotic method.The results indicated that the chromosome number was 2n=120 and karyotype formula was 2n=120=96 m (6SAT)+18 sm (4 SAT)+4 st+2 T.According to index of relative length,chromosomes are composed of 16 L+26M2+60M1+18 S.The absolute length was from 0.688 to 2.628 μm and the relative length was from 0.869% to 3.319%,which was classified into micro type and small type.The coefficient of asymmetric was 58.13%.The ratio of the longest chromosome to the shortest was 3.819 and the proportion of arm exceeding 2∶1 was 11.67%.The karytype belonged to “2 B” type and whose evolution was relatively original.

DioscoreaoppositaThunb.; chromosome number; karyotype analysis

2014-10-29

国家自然科学基金项目(31360480)

周翼虎(1986-)，男，山西翼城人，硕士研究生，从事蔬菜遗传育种工作。

霍秀文(1968-)，女，内蒙古包头人，教授，博士。

1000-2340(2015)03-0305-06

S 632.1

A