火箭煤油对小鼠细胞免疫的抑制作用观察

徐冰心，刘志国，司少艳，李成林，娄晓同，杨鹤鸣，李建忠，王建营，崔彦

火箭煤油对小鼠细胞免疫的抑制作用观察

徐冰心，刘志国，司少艳，李成林，娄晓同，杨鹤鸣，李建忠，王建营，崔彦

目的观察皮肤涂抹火箭煤油(RK)对小鼠细胞免疫的抑制作用。方法建立皮肤迟发超敏反应(DTH)模型，观察皮肤火箭煤油的涂抹剂量与其细胞免疫功能抑制作用之间的关系。阴性对照和阳性对照组ICR雌性小鼠背部涂抹丙酮，火箭煤油组涂抹特定剂量及一定次数的火箭煤油(低剂量：0.5ml/kg；中剂量：1ml/kg；高剂量：2ml/kg)，每组6只。通过测定耳肿胀度判定火箭煤油的免疫抑制作用。阳性对照组和各实验组采用1%二硝基氟苯(DNFB)致敏。①不同剂量RK染毒1次：分为阴性对照组、阳性对照组、火箭煤油低剂量组、火箭煤油中剂量组、火箭煤油高剂量组；②同一剂量RK不同染毒次数(1次/d，天数不同)：分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量RK 1次染毒组、低剂量RK 2次染毒组、低剂量RK 3次染毒组、低剂量RK 4次染毒组、低剂量RK 5次染毒组；③不同剂量RK 5次染毒(1次/d，连续5d)：分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量RK 5次染毒组、中剂量RK 5次染毒组、高剂量RK 5次染毒组。采用体外培养的淋巴细胞增殖活性实验等方法观察皮肤涂抹RK的细胞免疫抑制持续时间，MTT法观察刀豆蛋白A(ConA)诱导的淋巴细胞增殖活性，流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+和CD8+)和脾淋巴细胞细胞周期。结果RK 1次染毒能降低DNFB致敏引起的ICR小鼠耳肿胀、脾脏系数升高及胸腺指数降低(P<0.05)，RK对小鼠的细胞免疫抑制作用随剂量与染毒次数的增加而增加。RK 1次染毒可以降低ConA诱导的脾淋巴细胞增殖且持续至染毒后20d仍有显著差异(P<0.05)，染毒后第10天CD4+/CD8+比值显著降低。结论皮肤染毒RK对小鼠细胞免疫具有明显的抑制效应。

火箭煤油；细胞免疫抑制；超敏反应，迟发型；淋巴细胞

火箭煤油(rocket kerosene，RK)又称航天煤油，是一种高密度、低凝点、高品质的高热稳定性大型火箭发动机用煤油，适用于新型大推力运载火箭煤油发动机，将作为中国新一代大推力运载火箭的主体推进剂投入到航天发射中。火箭煤油的碳数分布为C9～C15，目前鉴定出的组分包括烷烃(16.68%)、单环环烷烃(16.13%)、双环环烷烃(51.51%)、三环环烷烃(1.00%)、烯烃(0.08%)、芳烃(0.86%)和含氧化合物(1.44%)7大类[1]。煤油可对人体中枢神经系统、呼吸系统、皮肤等产生一定的损害作用[2-3]，但火箭煤油的毒性研究以及人体接触和发病的资料鲜见报道。皮肤接触中毒是职业作业过程中一种最常见且无法避免的伤害，一方面防护用品破损时火箭煤油有可能直接沾染，另一方面当蒸汽压下降时，火箭煤油可由气态转化成液态，导致暴露在空气中的皮肤被沾染。皮肤接触火箭煤油致敏性较弱，具有轻中度刺激性[4-5]，但目前尚未见其对免疫功能影响的研究。本研究观察小鼠皮肤染毒火箭煤油对细胞免疫功能的影响，旨在为评价皮肤接触火箭煤油的免疫抑制作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 火箭煤油(航天一院101研究所，20110805)；二硝基氟苯(DNFB，北京蓝博斯特生物技术有限公司)；抗小鼠CD3-PerCP、CD4-FITC 和CD8-PE抗体(美国eBioscience公司)；碘化丙啶(PI，美国Sigma公司)；RNase(美国Sigma公司)。流式细胞仪(FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司)，全自动血球计数仪(KX21，日本SYSMEX公司)，酶联免疫光谱分析仪(BIO-RAD680美国伯乐公司)，二氧化碳培养箱(MCO-15AC，日本三洋公司)，离心机(PrimoR，德国Heraeus公司)。

1.2 实验动物及分组 ICR小鼠150只，体重18～22g，雌性，购自北京医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(京)2006-0008，动物室通风条件较好，温度20～25℃，湿度40%～70%，光照12h明暗交替。迟发超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)实验按照小鼠体重进行随机分组，每组6只。第一系列实验为不同剂量火箭煤油皮肤1次染毒：分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量组(0.5ml/kg)、中剂量组(1ml/kg)、高剂量组(2ml/kg)组；第二系列实验为同一剂量火箭煤油不同次数染毒(不同天数，1次/d，各组末次染毒同天完成)：分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量×1次组、低剂量×2次组、低剂量×3次组、低剂量×4次组、低剂量×5次组；第三系列实验为不同剂量火箭煤油多次染毒(1次/d，共5d)：分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量组×5次组、中剂量组×5次组、高剂量组×5次组。阴性对照组和阳性对照组涂抹丙酮，各剂量实验组涂抹相应剂量的火箭煤油。小鼠脾淋巴细胞增殖和外周血淋巴细胞亚群实验按照小鼠体重进行随机分组，每组24只，分为阴性对照组和火箭煤油组，火箭煤油组采用中剂量(1ml/kg)火箭煤油1次染毒，分别于染毒后5、10、20、30d进行检测，每组每时间点6只动物。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠皮肤染毒模型的建立 小鼠背部用电推去毛，范围约3cm×3cm，用外科胶布粘掉残留碎毛，定量涂抹受试物。

1.3.2 DNFB所致DTH实验[6]按照分组方法涂抹火箭煤油，对照组涂抹丙酮。末次涂抹3h后除阴性对照组外将50µl新鲜配制的1% DNFB溶液(丙酮:麻油=1:1)均匀涂抹于鼠背上。第2天DNFB强化1次。DTH的产生与测定：致敏后第5天，将1% DNFB溶液20µl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h可见右耳明显肿胀，颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剪下左右耳廓，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。同时取小鼠胸腺及脾脏称重。肿胀度=右耳片重量－左耳片重量。肿胀率=(右耳片重量－左耳片重量)/左耳片重量×100%。脾指数=脾重(mg)/小鼠体重(g)×10。胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)×10。

1.3.3 脾淋巴细胞增殖活性实验[7]各组小鼠处死后无菌取脾脏，加入RPMI 1640培养液中研磨，过200目细胞网，离心，弃上清，加入1ml Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞5min，PBS洗2次，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬，调整细胞浓度为1×107/ ml，将细胞悬液加入96孔培养板(100µl/孔)，每孔加入100µg/ml刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)溶液5µl(预实验显示ConA最适作用浓度为5µg/ml)，设5个复孔。另设空白对照组(每孔加100µl细胞悬液和100µl RPMI 1640培养液)，设3个复孔。于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，每孔加MTT溶液20µl，在培养箱内继续孵育4h，吸弃上清，加DMSO 200µl，充分振荡均匀，在酶标仪490nm处测吸光度(A)值。脾淋巴细胞增殖A值=样本孔平均A值－空白孔平均A值。

1.3.4 外周血T淋巴细胞亚群检测 小鼠摘眼球取血，置于EDTA抗凝采血管中，取50µl抗凝血，按照试剂说明书加入适量CD3-PerCP、CD4-FITC和CD8-PE抗体，室温避光放置30min，加入稀释溶血素(1:10)溶血10min，1000r/min离心5min，PBS洗涤1次，加PBS 400µl重悬细胞，上流式细胞仪检测。FSC/SSC淋巴细胞设R1门，CD3-PerCP/SSCT淋巴细胞设R2门，分析R1且R2门内CD4+细胞和CD8+细胞占CD3+细胞的百分比，计算CD4+/CD8+比值。

1.3.5 外周血白细胞和淋巴细胞计数 取20µl抗凝血，加500µl细胞稀释液稀释，采用全自动血球计数仪进行分析。

1.3.6 脾脏淋巴细胞周期的分析 取1×106个脾淋巴细胞，加300µl PBS重悬，加700µl预冷无水乙醇，混合均匀，置－20℃冰箱内固定48h以上，加2ml PBS，1000r/min离心5min，弃上清，加入100µl RNAase(100µg/ml)室温放置10min后，加入PI溶液300µl(终浓度50µg/ml)，－4℃染色10min，上流式细胞仪检测。FSC/SSC散点图对淋巴细胞设门，FL2-W/FL2-A散点图去除粘连细胞，FL2-A直方图区分G0/G1和G2/M期细胞，低速获取细胞，Modifit软件分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0.0软件进行统计分析，数据结果以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同剂量火箭煤油一次染毒对DNFB所致DTH的影响 与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数显著增加(P<0.05)，胸腺指数显著降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，中剂量组(1ml/kg)和高剂量组(2ml/kg)小鼠耳肿胀度和肿胀率显著降低，胸腺指数显著升高(P<0.05)，且随染毒剂量增加，变化趋势更为明显(表1)。

表1 不同剂量火箭煤油皮肤一次染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab. 1 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through one time dermal exposure (±s,n=6)

表1 不同剂量火箭煤油皮肤一次染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab. 1 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through one time dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

Group Swelling degree (g) Swelling rate (%) Spleen index (g/g) Thymus index (g/g) NC 0.58±0.31 3.24±1.45 0.441±0.030 0.330±0.274 PC 31.45±1.57(1) 186.45±9.49(1) 0.625±0.049(1) 0.239±0.030(1)RK 0.5ml/kg×1 29.8±7.01 162.77±32.48 0.613±0.048 0.267±0.033 RK 1ml/kg×1 25.7±3.4(2) 158.69±21.71(2) 0.613±0.034 0.289±0.012(2)RK 2ml/kg×1 20.28±2.1(2) 108.65±16.08(2) 0.617±0.013 0.290±0.007(2)

2.2 同一剂量火箭煤油不同次数染毒对DNFB所致DTH的影响 与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数显著增加，胸腺指数显著降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，低剂量×4次组小鼠脾指数显著降低(P<0.05)，低剂量×5次组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数显著降低，胸腺指数显著升高(P<0.05)，且随染毒次数增加，变化趋势更为明显(表2)。

2.3 不同剂量火箭煤油多次染毒对DNFB所致DTH的影响 与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数显著增加，胸腺指数显著降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，低、中、高剂量×5次组小鼠耳肿胀度、肿胀率、脾指数均显著降低，胸腺指数均显著升高(P<0.05)，且随染毒剂量增加，变化趋势更为明显(表3)。

2.4 火箭煤油皮肤染毒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 与阴性对照组比较，火箭煤油组染毒后10d小鼠CD4+/CD8+比值显著降低(P<0.05)，而其余各时间点两组比较差异无统计学意义(图1)。

2.5 火箭煤油皮肤染毒对小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的影响 与阴性对照组比较，火箭煤油组染毒后第5、10、20天脾淋巴细胞增殖A值显著降低(P<0.05)，染毒后第30天两组比较差异无统计学意义(图2)。

2.6 火箭煤油皮肤染毒对小鼠脾淋巴细胞周期的影响 与阴性对照组比较，火箭煤油组小鼠脾淋巴

表2 同一剂量火箭煤油皮肤不同次数染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab. 2 Suppression of delayed type hypersensitivity by same dosage of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

表2 同一剂量火箭煤油皮肤不同次数染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab. 2 Suppression of delayed type hypersensitivity by same dosage of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

Group Swelling degree (g) Swelling rate (%) Spleen index (g/g) Thymus index (g/g) NC 0.80±0.29 5.73±2.39 0.407±0.0581 0.331±0.034 PC 22.93±4.90(1) 159.18±38.79(1) 0.762±0.086(1) 0.295±0.022(1)RK 0.5ml/kg×1 21.47±4.17 156.47±29.53 0.735±0.072 0.296±0.034 RK 0.5ml/kg×2 21.08±6.59 141.27±34.79 0.774±0.180 0.331±0.067 RK 0.5ml/kg×3 20.36±5.98 142.51±35.53 0.850±0.145 0.307±0.017 RK 0.5ml/kg×4 18.78±6.63 133.95±47.61 0.650±0.106(2) 0.352±0.040 RK 0.5ml/kg×5 13.38±2.06(2) 98.60±18.96(2) 0.554±0.439(2) 0.356±0.032(2)

表3 不同剂量火箭煤油多次染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab.3 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

表3 不同剂量火箭煤油多次染毒对迟发超敏反应的影响(±s，n=6)Tab.3 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

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图1 火箭煤油皮肤染毒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响(±s，n=6)Fig. 1 Effect of RK on T lymphocyte subsets of mice (±s,n=6)NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

图2 火箭煤油皮肤染毒对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(±s，n=6)Fig. 2 Effect of RK on spleen lymphocyte proliferation of mice (±s,n=6)NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

细胞在染毒后第10天和第20天G0/G1期细胞百分比显著下降，S期细胞百分比显著升高(P<0.05)，在染毒后第30天G0/G1期和S期细胞百分比与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。染毒后第10天火箭煤油组小鼠脾淋巴细胞G0/G1期细胞百分比显著高于阴性对照组(P<0.05)，其余时间点两组比较差异无统计学意义(图3)。

2.7 火箭煤油皮肤染毒对小鼠外周血WBC和淋巴细胞数量的影响 与阴性对照组比较，火箭煤油组小鼠染毒后第5、10、20天外周血WBC数显著上升，染毒后第10、20天外周血淋巴细胞数显著上升(P<0.05)，而染毒后各时间点淋巴细胞百分比两组间比较差异均无统计学意义(图4)。

3 讨 论

与传统的火箭推进剂四氧化二氮或偏二甲基肼比较，火箭煤油被认为是一种绿色推进剂，其安全性明显增强，毒性明显降低，但是职业接触火箭煤油还是存在对人体产生危害的可能性。有文献报道，长期接触煤油的工人白细胞数量明显降低，淋巴细胞数量明显增加[2]，提示火箭煤油可能对免疫系统有一定影响。因此本研究采用多种方法评价火箭煤油对细胞免疫功能的抑制作用。

DTH是由CD4+Th1细胞介导的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的细胞免疫反应[7]，其中T细胞在移植物排斥、移植物抗宿主病、自身免疫和肿瘤免疫等方面起着关键作用，是机体细胞免疫功能的体现[8-9]。DTH动物模型最常采用的是小鼠T细胞依赖的迟发型超敏反应模型。DNFB是一种免疫原性比较稳定的半抗原，将其溶液涂抹皮肤后，与皮肤蛋白结合形成完全抗原，可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4～7d后将其再次涂抹于皮肤，可使局部产生迟发型变态反应，并在抗原攻击后24～48h到达高峰，于此时测定局部肿胀可反映迟发型皮肤超敏反应的强度[6]。DTH动物模型是检测细胞免疫抑制最为常用的方法，通过观察化合物作用后DTH模型小鼠耳肿胀的减轻程度，可判定该化合物在体内对T细胞介导的免疫应答的抑制作用。本研究结果显示，DTH模型小鼠背部皮肤1次染毒(1ml/kg火箭煤油)可见明显免疫抑制作用(20g小鼠体表面积为0.0044m2)，经换算，即成人皮肤接触85ml火箭煤油1次即可产生明显的免疫抑制作用(70kg作业人员体表面积为1.87m2)，该剂量是作业人员日常工作中皮肤很可能接触到的剂量；接触火箭煤油所引起的免疫抑制效应不仅与剂量有关，还与接触次数有关，小鼠1次接触0.5ml/kg火箭煤油1d，未观察到明显的免疫抑制效应，但是连续5d，每天1次接触火箭煤油，可产生明显的免疫抑制作用[9]，提示即使低剂量的火箭煤油也应避免反复多次皮肤接触。

图3 火箭煤油皮肤染毒对小鼠脾淋巴细胞周期的影响(n=6)Fig. 3 Effect of RK on cell cycle of spleen lymphocyte of mice (n=6)A. Proportion of cells in G0/G1phase; B. Proportion of cells in S phase; C. Proportion of cells in G2/M phase. NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

图4 火箭煤油皮肤染毒对外周血WBC和淋巴细胞数量的影响(n=6)Fig. 4 Effect of RK on the number of WBC and LYM in peripheral blood of mice (n=6)A. Number of white blood cell; B. Number of lymphocyte; C. Percentage of lymphocyte. NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

成熟的淋巴细胞经刺激剂诱导发生增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和免疫功能检测的一种常用方法。ConA作为多克隆刺激剂可选择性地刺激小鼠T细胞增殖，可用于了解机体的细胞免疫功能。与阴性对照组比较，小鼠背部皮肤1次染毒1ml/kg火箭煤油后第5、10、20天脾淋巴细胞增殖显著下降，染毒后第30天仍可见脾淋巴细胞增殖有降低趋势，提示小鼠1次染毒1ml/kg火箭煤油后第5天细胞免疫功能即有下降，染毒后20d仍显著下降，染毒后30d仍有降低趋势，表明小鼠1次染毒火箭煤油即可产生较长时间的免疫抑制作用。T淋巴细胞是机体免疫系统实现细胞免疫和免疫调节的主要成分，外周血T淋巴细胞亚群测定可反映机体免疫状态，CD4+/CD8+比值可评估机体免疫功能。与阴性对照组比较小鼠在染毒后第10天CD4+/CD8+比值显著下降，提示染毒后第10天细胞免疫水平低下[11]。

火箭煤油染毒小鼠T细胞免疫功能下降的同时，染毒后第10天和第20天脾淋巴细胞G0/G1期细胞百分比显著下降，S期细胞百分比显著上升，表明与正常组小鼠比较，火箭煤油染毒后脾淋巴细胞周期分布发生了变化。正常小鼠的脾细胞周期主要是相对静止的G0/G1期，S期细胞比例较低，而火箭煤油染毒后小鼠脾淋巴细胞的S期比例显著增加，S期为DNA合成期，反映了细胞的增殖状态，故该结果提示火箭煤油染毒后脾淋巴细胞增殖能力增强[12]，这与染毒后第5、10、20天小鼠外周血WBC和淋巴细胞数量显著增多的结果一致，推测可能与染毒后淋巴细胞免疫功能低下所引起的代偿性增生有关，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究在整体动物和细胞水平对火箭煤油的免疫抑制作用进行了观察，结果发现其具有一定的免疫毒性。鉴于皮肤接触火箭煤油可引起较强的细胞免疫抑制作用，并持续较长时间，作业过程中应严格做好皮肤防护，避免皮肤沾染，其具体的免疫抑制作用机制有待于进一步研究。

[1]Zhang GY, Peng QT, Sheng T. GC-MS determination of components in rocket kerosene and rocket kerosene vapour[J]. Missil Space Veh, 2011, (4): 59-62. [张光友, 彭清涛, 盛涛. 气相色谱-质谱法分析火箭煤油组成的再研究及火箭煤油蒸汽的组成分析[J]. 导弹与航天运载技术, 2011, (4): 59-62.]

[2]Zhang XQ, Wang Y, Yu SQ,et al. Analysis of the health of workers exposed to kerosene[J]. Occup Health, 1989, (1):42-44. [张晓勤, 王颖, 于书庆, 等. 接触煤油作业工人健康状况分析[J].职业与健康, 1989, (1): 42-44.]

[3]You QW, Li AL, Song XL. Neurobehavioral function among kerosene exposed workers[J]. Youjiang Med J, 2006, 34(4): 353-354. [尤庆伟, 李爱钦, 宋秀丽. 煤油对作业人员神经行为功能的影响[J]. 右江医学, 2006, 34(4): 353-354.]

[4]Xu BX, Liu ZG, Li CL,et al. Study the dermal irritation effects of rocket kerosene on rabbit[J]. Chin J Aerosp Med, 2012, 23(4): 278-231.[徐冰心, 刘志国, 李成林, 等.火箭煤油对家兔的皮肤刺激性研究[J]. 中华航空航天医学杂志, 2012, 23(4): 278-231.]

[5]Xu BX, Wang JY, Si SY,et al. Study on skin allergens effect caused by rocket kerosene[J]. Chin J Aerosp Med, 2014, 25(4): 280-285. [徐冰心, 王建营, 司少艳, 等. 火箭煤油的动物皮肤致敏性研究[J]. 中华航空航天医学杂志, 2014, 25(4): 280-285.]

[6]Wang XR. Toxicology test methods and techniques[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 2003. 52. [王心如. 毒理学实验方法与技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2003. 52.]

[7]Li L, Zhang XP, Wang QS,et al. Effects of compound capsule containing bifidobacterium and lactobacillus acidophilus on immunity function of mice[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2010, 45(4): 635-637. [李立, 张新萍, 王秋水, 等. 复合双歧胶囊对小鼠免疫功能的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2010, 45(4): 635-637.]

[8]Cher DJ, Mosmann TR. Two types of murine helper T cell clone II. Delayed-type hypersensitivity is mediated by TH1 clones[J]. J Immunol, 1987, 138(11): 3688-3694.

[9]Moorhead JW. Tolerance and contact sensitivity to DNFA in mice. Ⅷ. Identification of distinct T cell subpopulations that mediatein vivoandin vitromanifestations of delayed hypersensitivity[J]. J Immunol, 1978, 120(1): 137-144.

[10] Xu SY, Bian RL. Pharmacological experiments methodology[M]. 2nd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2002. 202.[徐叔云,卞如濂. 药理实验方法学[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. 202.]

[11] Hu JZ, Li Y. Research progress of correlation between Th1/Th2 imbalance with disease[J]. West Chin Med J, 2009, 24(1): 236-237. [胡佳哲, 李云. Th1/Th2失衡与疾病相关性的研究进展[J]. 华西医学, 2009, 24(1): 236-237.]

[12] Chen J, Huo J, Jia Z,et al. Effects of atrazine on the proliferation and cytotoxicity of murine lymphocytes with the use of carboxyfluorescein succinimidyl ester-based flow cytometric approaches[J]. Food Chem Toxicol, 2015, 76: 61-69.

Cell-mediated immune suppression effect of rocket kerosene through dermal exposure in mice

XU Bing-xin1, LIU Zhi-guo1, SI Shao-yan1, LI Cheng-lin2, LOU Xiao-tong1, YANG He-ming2, LI Jian-zhong1, WANG Jian-ying3*, CUI Yan2*1Special Medicine and Experimental Research Center,2Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China
3Epidemic Prevention Team, General Equipment Department of PLA, Beijing 100101
*< class="emphasis_italic">Corresponding authors. WANG Jian-ying, E-mail: jiafm@sina.com; CUI Yan, E-mail: dryancui@163.com

s. WANG Jian-ying, E-mail: jiafm@sina.com; CUI Yan, E-mail: dryancui@163.com
This work was supported by the Science and Technique Foundation of Logistic Department of General Equipment Department of PLA (CZZ11C004)

ObjectiveTo study the effect of cell-mediated immune suppression effect of rocket kerosene (RK) through dermal application in mice.MethodsSkin delayed type hypersensitivity (DTH) was used to observe the relation of the RK amount the skin exposed and the cellular immune inhibitory function. Different amount of the undiluted fuel was smeared directly onto the dorsal skin of mice. Mice in negative and positive control groups were treated with acetone. After the last exposure, all the mice except those in negative control group were allergized by evenly smearing with 1% dinitrofluorobenzene (DNFB) solution on their dorsum. Five days after allergy, 1% DNFB solution was smeared onto right ear of all mice to stimulate the allergic reaction. Twenty-four hours after attack, the auricle swelling, spleen index and thymus index in corresponding mice were determined. In the first series of experiments, different dosages of RK were applied once, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×1, 1ml/kg.BW×1 and 2ml/kg.BW×1 group). In the second series of experiments, the certain and same dosage of RK was applied for different times, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×1, 0.5mL/kg.BW×2, 0.5ml/kg.BW×3, 0.5ml/kg.BW×4 and 0.5mL/kg.BW×5 group). In the third series of experiments, the different dosages of RK were applied morethan once, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×5, 1ml/kg.BW×5 and 2ml/kg.BW×5 group). Lymphocyte proliferation experimentin vitrowas conducted to observe the persistent time of the cell-mediated immune suppression in mice by RK dermal exposure. The lymphocyte proliferation induced by concanavalin A (Con A) was analyzed by MTT assay, and T lymphocyte subsets (CD3+, CD4+and CD8+) in peripheral blood and spleen lymphocyte cell cycle were analyzed by flow cytometry.ResultsRK dermal exposure (1ml/kg.BW×1) alleviated the ear edema, suppressed the spleen index elevation and thymus index reduction caused by DNFB sensitization in ICR mice, and the suppression effect increased with exposed dosage and time increasing. RK dermal exposure (1ml/kg.BW×1) suppressed ConA-induced spleen lymphocyte proliferation, and the effect persisted for 20d (P<0.05). The CD4+/CD8+ratio in peripheral blood was lower in RK group than in negative control group (P<0.05).ConclusionDermal exposure of RK may have cell-mediated immunotoxicity.

rocket kerosene; cell-mediated immune suppression; hypersensitivity, delayed; lymphocytes

R858.3

A

0577-7402(2015)08-0671-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.14

2015-05-30；

2015-06-29)

(责任编辑：沈宁)

解放军总装备部后勤科研项目(CZZ11C004)

徐冰心，药学博士。主要从事航天意外伤及防护方面的研究

100101 北京 解放军306医院特种医学实验研究中心(徐冰心、刘志国、司少艳、娄晓同、李建忠)，普通外科(李成林、杨鹤鸣、崔彦)；100101 北京 总装备部防疫大队(王建营)

王建营，E-mail：jiafm@sina.com；崔彦，E-mail：dryancui@163.com