头顶一颗珠提取液对大鼠脊髓损伤后CNTF及CNTFRα表达的影响

2015-06-28陈显兵朱旻玥覃芙蓉唐尚权王凤杰龙波霖袁德培

解放军医学杂志 2015年8期

陈显兵，朱旻玥，覃芙蓉，唐尚权，王凤杰，龙波霖，袁德培

陈显兵，朱旻玥，覃芙蓉，唐尚权，王凤杰，龙波霖，袁德培

目的观察百合科延龄草属植物头顶一颗珠干燥根茎提取液对大鼠急性脊髓损伤模型睫状神经营养因子(CNTF)及其受体(CNTFRα)表达的影响。方法健康成年Wistar大鼠45只，随机分为对照组、模型组及实验组(n=15)，模型组及实验组参照Allen's法建立脊髓损伤模型，对照组不损伤脊髓。实验组于术前2周开始给予头顶一颗珠提取液灌胃，模型组和对照组给予同剂量蒸馏水灌胃。分别于伤后1d、7d，14d处死动物，取脊髓组织行HE染色观察组织病理学改变，Nissl染色观察Nissl小体的变化，并通过免疫组化染色、Western-blotting及RT-PCR检测观察CNTF、CNTFRα mRNA及蛋白的表达情况。结果HE染色显示实验组脊髓结构比较清晰，神经细胞水肿、坏死较模型组减轻；Nissl染色见模型组和实验组损伤后各时相点脊髓前角运动神经元尼氏小体减少或消失，实验组尼氏小体减少程度较模型组明显减轻；免疫组化染色显示各组脊髓均有CNTF、CNTFRα蛋白表达。RT-PCR检测显示伤后7、14d模型组及实验组脊髓组织中CNTF、CNTFRα mRNA表达水平均明显高于对照组，且实验组明显高于模型组。Western blotting检测显示模型组伤后14d及实验组伤后7、14d脊髓组织中CNTF、CNTFRα蛋白表达水平明显高于对照组，且实验组伤后14d的表达水平均明显高于模型组。结论头顶一颗珠能上调脊髓组织中CNTF、CNTFRα的表达，对脊髓损伤有一定的保护作用。

脊髓损伤；睫状神经营养因子；延龄草

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后各种机制引起的神经细胞坏死和凋亡在其病程进展过程中起重要作用。由于脊髓再生能力有限，减少脊髓通路的破坏、抑制神经元及胶质细胞凋亡是提高脊髓损伤治疗效果的关键[1-2]。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)在中枢及周围神经系统中广泛存在，在神经受到损伤后与其受体CNTFRα特异性结合，对损伤后神经的再生具有重要作用[3]。头顶一颗珠(Trillium tschonoskiiMaxim)系百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎(俗称地珠)，作为土家族地区的珍稀药材，被土家族人奉为“神药”，主要含有甾体皂甙、黄酮苷及倍半萜苷等有效成分[4]，具有抗癌、抗炎、镇痛、提高免疫力、改善心功能和降压、抗衰老等功效[5-6]。本实验模拟重物打击法建立脊髓损伤大鼠模型，观察脊髓损伤后CNTF及其受体的表达变化及头顶一颗珠提取液的影响，为头顶一颗珠的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器药材头顶一颗珠于2013年9月采自巴东及神农架林区，经湖北民族学院医学院中药实验室鉴定为延龄草，药材经60℃恒温烘箱干燥后粉碎，用75%乙醇浸泡数小时后回流提取，将提取液滤过并减压浓缩、干燥，得到延龄草总提取物。加适量去离子水至总提取物全部溶解，采用水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩干燥，得到萃取物。以延龄草对照品制作标准曲线，紫外可见光光度测定药品总皂苷含量为14.72mg/g药材。兔抗大鼠CNTF及CNTFRα抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学试剂盒为武汉博士德产品，RT-PCR试剂盒为上海生物工程公司产品。德国Eppendorf公司Mastercycler pro PCR扩增仪，Leica 1850冰冻切片机，Leica 2245石蜡切片机，美国Bio-Rad公司凝胶成像分析系统。

1.2 实验分组健康Wistar大鼠45只(由湖北省实验动物中心提供)，体重185～255g，鼠龄4个月，随机分为3组，每组15只。A组：对照组，常规喂养，单纯手术，不打击脊髓。B组：模型组，常规喂养，手术并打击脊髓。C组：头顶一颗珠处理组，实验前2周开始给予浓度1g/L的头顶一颗珠提取液2ml灌胃，每天3次(A组和B组给予同剂量蒸馏水灌胃)。A、B、C组又分为术后1d、7d和14d亚组，每个亚组5只大鼠。术后青霉素40万U常规肌内注射，1次/d，分笼饲养。

1.3 脊髓急性损伤模型的制备实验动物以2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，参照改良Allen重物打击法[7]建立大鼠急性脊髓损伤模型。将动物俯卧位固定于手术台，背部剪毛，切除T9-T11棘突及椎板，暴露硬脊膜，用5.0g铜制重物在玻璃棒引导下自5cm高度自由落下撞击暴露区，以观察到鼠尾痉挛性摆动、双下肢猛烈收缩为建模成功的标志。逐层关闭切口，敷料覆盖伤口并加以固定。

1.4 标本取材大鼠按实验亚组分组达到相应时相点后再次麻醉，根据不同实验取材方法如下：①用于RT-PCR、Western blotting检测的大鼠活杀后取T9-T11节段置于液氮中保存备用；②用于常规及免疫组化检测的大鼠，先用生理盐水200ml经心脏行主动脉灌注，待流出液体变清，以4%中性多聚甲醛400ml灌注30min，获取T9-T11节段，4%中性多聚甲醛保存。

1.5 HE及Nissl染色石蜡标本常规切片，片厚5µm，常规行HE染色；Nissl染色时将固定标本放入30%蔗糖至标本沉底，冰冻切片，片厚20µm，水洗后加入工作液15min，常规脱水封片。

1.6 CNTF、CNTFRα免疫组化染色取每组大鼠脊髓，用免疫组织化学链霉卵白素复合物(streptavidin peroxidase，SP)法染色，片厚10µm，以PBS代替一抗作为阴性对照。每隔5张切片取1张，共5张，用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统对脊髓前角运动神经元灰度值进行测量分析。

1.7 脊髓总RNA的提取和RT-PCR测定大鼠活杀后取T9-T11脊髓，采用Trizol试剂盒提取总RNA。引物由上海生物工程公司合成，序列如下：CNTF，正义5'-CTTTCGCAGAGCAAACACCTC-3'，反义5'-ACTGTGAGAGCTCTTGAAGGAC-3'，产物大小497bp；CNTFRα，正义5'-AGGAGGCACCCCATGT TCAG-3'，反义5'-CATGTCACCTCCAGTCGACG-3'，产物大小603bp；GAPDH，正义5'-ACCCCTTCATT GACCTCAACTA-3'，反义5'-ATTGGGGGTAGGAAC ACGGAA-3'，产物大小613bp。其中GAPDH为内参照。采用RT-PCR试剂盒测定CNTF及CNTFRα mRNA的表达，具体操作按说明书进行。采用凝胶图像分析仪对电泳条带进行分析，测定CNTF mRNA/GAPDH mRNA和CNTFRα mRNA/GAPDH mRNA吸光度(A)的比值。

1.8 脊髓蛋白的提取和Western blotting检测取大鼠脊髓组织，PBS(pH 7.2)清洗2次，弃去PBS，加入1ml RIPA裂解液，冰浴条件下进行匀浆；4℃下10 000×g，离心10min，去除沉淀，留取上清。用BCA法进行蛋白定量，取60µg蛋白加入上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，用PBS配制的5%脱脂奶粉室温封闭2h，加一抗羊抗鼠CNTF IgG(200µg/ml，1:200)或CNTFRα(200µg/ml，1:200)4℃孵育过夜，PBS洗膜3次，每次15min，再加入二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1:7500)37℃孵育60min，PBS洗膜3次，每次10min，暗室加发光剂2min，压片，显影，定影，水洗，以GAPDH为内参照，用分子生物学图像分析系统测定各目的条带A值。

1.9 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据结果以表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓组织学改变 HE染色结果显示，对照组脊髓结构清晰，神经元无水肿变性；模型组脊髓组织可见炎症细胞浸润，神经元细胞间隙增大，细胞突起减少或消失，神经细胞水肿、坏死；头顶一颗珠处理组脊髓结构比较清晰，神经细胞水肿、坏死较模型组轻。Nissl染色光镜观察显示，对照组神经元尼氏小体着色呈虎斑状，分布均匀，模型组和头顶一颗珠处理组损伤后各时相点脊髓前角运动神经元尼氏小体减少或消失，头顶一颗珠处理组尼氏小体减少程度较模型组明显减轻(图1)。

2.2 脊髓组织CNTF、CNTFRα免疫组化染色检测结果 CNTF、CNTFRα免疫组化阳性染色均棕黄色颗粒，位于胞质中。3组均有CNTF、CNTFRα表达，模型组及头顶一颗珠处理组伤后1、7、14d表达均增强，且头顶一颗珠处理组表达高于模型组(图2)。

2.3 脊髓组织CNTF及CNTFRα mRNA表达水平RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组及头顶一颗珠处理组脊髓中CNTF和CNTRFα mRNA表达水平随伤后时间延长逐渐增强，且头顶一颗珠处理组表达水平高于模型组(表1，图3)。

2.4 脊髓组织CNTF、CNTFRα蛋白表达水平Western blotting检测结果显示，模型组伤后14d时脊髓组织中CNTF、CNTFRα蛋白表达明显高于对照组，头顶一颗珠处理组伤后7d及14d时CNTF蛋白表达明显高于对照组，伤后1、7、14d时CNTFRα蛋白表达明显高于对照组，且伤后14d时CNTFR蛋白表达明显高于模型组，伤后7d及14d时CNTFRα蛋白表达明显高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，图4，表2)。

图1 各组脊髓运动神经元尼氏小体变化(Nissl ×100)Fig. 1 The Nissl body of spinal cord motor neurons (Nissl ×100)A. Group A, Nissl body of spinal cord motor neurons; B. Group B, Nissl body of spinal cord motor neurons reduced; C. Group C, compared with the model group, the change of spinal cord motor neurons was slight

图2 各组脊髓运动神经元CNTF和CNTFRα的表达(SP ×200)Fig. 2 Expression of CNTF and CNTFRα on motor neuron of the spinal cord in rats (SP ×200)A. Group A, expression of CNTF; B. Group B, 7d post-injury, expression of CNTF; C. Group C, 7d post-injury, expression of CNTFα

表1 各组脊髓组织CNTF、CNTFRα mRNA的表达(±s，n=5)Tab. 1 Expression of CNTF and CNTFRα mRNA in the spinal cord in rats (±s,n=5)

(1)P<0.05 compared with group A; (2)P<0.05 compared with group B

Group CNTF mRNA CNTFRα mRNA 1d 7d 14d 1d 7d 14d A 0.15±0.02 0.14±0.03 0.15±0.03 0.25±0.02 0.24±0.03 0.27±0.01 B 0.14±0.05 0.27±0.03(1) 0.49±0.04(1) 0.34±0.05 0.40±0.04(1) 0.55±0.04(1)C 0.19±0.07 0.38±0.01(1)(2) 0.62±0.02(1)(2) 0.34±0.04 0.55±0.01(1)(2) 0.78±0.02(1)(2)

图3 各组脊髓组织CNTF和CNTFRα mRNA表达检测Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of CNTF and CNTFRα mRNALane 1. Group C, 14d post-injury; Lane 2. Group C, 7d postinjury; Lane 3. Group C, 1d post-injury; Lane 4. Group B, 14d postinjury; Lane 5. Group B, 7d post-injury; Lane 6. Group B, 1d postinjury; Lane 7. Group A, 14d post-injury; Lane 8. Group A 7d postinjury;Lane 9. Group A 1d post-injury; M. Marker

图4 各组脊髓组织CNTF、CNTFRα蛋白表达水平的Western blotting检测结果Fig. 4 Protein expression of CNTF and CNTFRα in spinal cord of each group detected by Western blotting

表2 各组脊髓组织CNTF、CNTFRα蛋白表达(±s，n=5)Tab. 2 Protein expression of CNTF and CNTFRα in spinal cord of each group (±s,n=5)

(1)P<0.05 compared with group A; (2)P<0.05 compared with group B

Group CNTF 449±80 406±62 581±104(1) 445±72 320±55 525±58(1)C 491±76 581±68(1) 844±83(1)(2) 486±40(1) 592±66(1)(2) 903±38(1)(2)CNTFRα 1d 7d 14d 1d 7d 14d A 311±62 320±35 318±50 279±42 264±54 255±52 B

3 讨论

脊髓损伤是中枢神经系统的严重损伤，目前其预防和治疗是神经科学领域研究的热点。研究表明，脊髓损伤对机体的损害是由两种机制引起的，即原发损伤和继发损伤。原发损伤是指创伤本身对神经细胞的损伤，主要包括神经细胞坏死、轴索断裂等；继发损伤是在原发损伤后逐渐形成的，并伴随一系列细胞内代谢和基因的改变，包括水肿、炎症反应、局部缺血、兴奋性氨基酸的释放、脂质过氧化、钙离子超载等，最终导致神经细胞凋亡[8-9]。原发损伤是不可逆的，但通过早期积极、正确的医疗干预可预防和减轻继发损伤。

CNTF是目前研究比较多的营养因子之一，它不仅对体内外多种神经元及神经胶质细胞的存活具有促进作用，而且在促进轴突再生、防止受损神经元退变、维持运动神经元功能、诱导神经元和胶质细胞分化等方面也具有重要作用[10-12]。神经元能否维持正常的生理功能与神经营养因子密切相关，研究证实新生大鼠神经元在轴突切除后易发生变性、坏死，与神经内营养因子含量过低有关，神经营养因子的减少是诱发神经元退变的原因[13-14]。本课题组前期研究发现，在正常状态下脊髓灰质前角运动神经元中均有CNTF及CNTFRα表达，不同年龄组的含量存在一定差异，幼年组表达最高，其后逐步下降，这可能与不同年龄段对神经营养因子的需求不同有一定关系，同时还发现损伤后1d脊髓中CNTF及CNTFRα蛋白表达升高，损伤后7d、14d CNTF及CNTFRα蛋白和mRNA表达逐步升高，其后表达逐渐降低，推测在神经损伤后神经元及其周围的细胞可分泌更多的CNTF和CNTFRα，以促进神经损伤的修复[15]。CNTF具有多种生物活性，可减轻神经细胞的损伤，对损伤的神经元特别是运动神经元具有保护作用。CNTF在中枢及周围神经系统中广泛存在，其受体由CNTFRα、LIFR-β、gp130组成，其中CNTFRα是CNTF的特异性结合蛋白，在CNTF参与神经损伤修复过程中具有重要作用。

本研究发现，采用头顶一颗珠提取液干预后，脊髓损伤后1d时CNTF和CNTFRα的表达与模型组比较没有明显区别，但随着时间延长，伤后7d及14d时CNTF和CNTFRα的表达明显高于模型组(P<0.05)，表明头顶一颗珠干预后脊髓组织中CNTF、CNTFRα蛋白及mRNA表达上调，对脊髓损伤具有一定的保护作用，但其具体的机制有待进一步深入研究。

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Effect of extract ofTrillium tschonoskiiMaxim on ciliary neurotropic factor and its receptor α in rats suffering from spinal cord injury

CHEN Xian-bing1, ZHU Min-yue2, QIN Fu-rong2, TANG Shang-quan2, WANG Feng-jie1, LONG Bo-lin2, YUAN De-pei31Key Laboratory of Biologic Resource Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China
2Medical College,3College of Traditional Chinese Medicine, Hubei University for Nationalities, Enshi, Hubei 445000, China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81260521), the Natural Science Foundation of Hubei Province (2014CFB613), and the Fund of the Key Laboratory of Biologic Resource Protection and Utilization of Hubei Province (PKLHB1513)

ObjectiveTo investigate the effect ofTrillium tschonoskiiMaxim extract on the expression of ciliary neurotrophic factor (CNTF) and its receptor (CNTFRα) after spinal cord injury in rats.MethodsForty-five rats were equally and randomly divided into control group (group A), model group (group B) andTrillium tschonoskiiMaxim treated group (group C). Allen's weight drop method was used to reproduce acute spinal cord injury (SCI) model in rats of the group B and C. In group C, the rats were gavaged withTrillium tschonoskiiMaxim extract 2 weeks before the injury, while rats in group A and B were fed a same quantity of distilled water. 1, 7 or 14 days after injury, the rats were sacrificed to observe the structure of nerve cells after HE and Nissl staining, and the expression of CNTF and CNTFRα with immunohistochemical method, RT-PCR and Western blotting.ResultsHE staining showed that the structure of spinal cord in the the rats group C was more discernible, with milder edema and necrosis of nerve cells, as compared with that of group B. Nissl staining showed that Nissl bodies were decreased or disappeared in anterior horn motor neurons in both group B and C, but it was significantly less marked in group C than that in group B. Immunohistochemical staining, Western blotting and RT-PCR revealed that the protein and mRNA of CNTF and CNTFRα were positively expressed in rats of every group. The mRNA levels of CNTF and CNTFRα in group C were higher than those in group B.ConclusionsExtract ofTrillium tschonoskiiMaxim can up-regulate the expression of CNTF and CNTFRα, and plays a protective role against injury to spinal cord.

spinal cord injuries; ciliary neurotrophic factor;Trillium tschonoskii

R651.21

0577-7402(2015)08-0622-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.04

2014-11-28；

2015-06-27)

(责任编辑：胡全兵)

国家自然科学基金(81260521)；湖北省自然科学基金(2014CFB613)；生物资源保护与利用湖北省重点实验室基金(PKLHB1513)

陈显兵，医学硕士，副教授。主要从事脊髓损伤与修复的研究

445000 湖北恩施生物资源保护与利用湖北省重点实验室(陈显兵、王凤杰)；445000 湖北恩施湖北民族学院医学院(朱旻玥、覃芙蓉、唐尚权、龙波霖)；445000 湖北恩施湖北民族学院中医药学院(袁德培)