聚-γ-谷氨酸固体发酵基质及工艺参数优化

李文杰， 王 杰， 王鹏举， 赵晓行， 吴 坤

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)



聚-γ-谷氨酸固体发酵基质及工艺参数优化

李文杰， 王 杰， 王鹏举， 赵晓行， 吴 坤

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

以不同的聚谷氨酸固体发酵基质为研究对象，通过对其进行最优搭配，优化发酵条件，提高聚谷氨酸的产量，降低固体发酵成本。其中以黄豆粉为主要发酵基质的聚谷氨酸产量最高，以麸皮和秸秆为辅料基质均能大大提高聚谷氨酸的产量，分别为132.24 g·kg-1和145.79 g·kg-1，秸秆的效果更佳，因此选择秸秆为辅料基质进行发酵条件优化。最终确定发酵条件为：初始pH值7.0～7.5，含水率60%，温度37 ℃，发酵周期64 h。

固体发酵；解淀粉芽孢杆菌；聚谷氨酸；黄豆粉；秸秆；麸皮

聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过a-氨基和γ-羧基间的酰胺键组合而成的阴离子型多聚氨基酸。相对分子量在10～100万[1]。γ-PGA具有良好的生物相容性以及生物可降解性，修饰后可作为药物载体甚至与药物直接结合，增强药物缓释性、靶向性。在农业应用方面，γ-PGA是良好的保水剂和农药、肥料缓释剂，另外有研究证明γ-PGA可以提高绿色植物对光能的利用率[2,3]。因此在注重环保，强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物在医疗、农业、环境保护等诸多领域具有广泛的发展应用前景[4]。关于聚谷氨酸的生产报道以液体发酵居多，然而液体发酵在大规模生产过程中存在诸多问题，如溶氧率以及泡沫过剩引起溢料和染菌等。特别是发酵中后期因为黏度增大，发酵液的溶氧、传热以及传质等迅速降低，严重影响发酵产物的产量[5,6]。而固体发酵相比于液体发酵，在工艺设备以及发酵环境上要求都低很多。固体发酵过程中动力能耗少，成本低，而且聚谷氨酸的得率很高[4,7]。此外，固体发酵易于贮藏及运输，在农业级聚谷氨酸生产中更有优势。本研究以解淀粉芽孢杆菌的1株诱变菌株为菌种，以不同底物与辅料基质为研究对象，确定最佳的底物和辅料以及辅料比例，从而提高固体发酵聚谷氨酸的产率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备和试剂 微型植物粉碎机，Kjeltec 2300自动定氮仪,丹麦FOSS公司；ETHOSE微波消解器，美国CEM公司； ALPHAI-4LD-PLUS真空冷冻干燥机，德国CHRIST公司；2695 XE高效液相色谱仪,美国Waters公司；黄豆和豆粕购自某豆油厂；麸皮购自面粉厂；秸秆购自饲料加工厂；胰蛋白胨粉、酵母浸粉、氯化钠、无水乙醇、结晶乙酸钠均为分析纯。乙腈、正己烷为色谱纯。谷氨酸标品购自Alfa Aesar公司，聚谷氨酸标品购自台湾。

1.1.2 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌YP-B-2 (B.amyloliquefaciensYP-B-2)，河南农业大学微生物实验室筛选、鉴定和保存。

1.1.3 培养基 菌种保存培养基:胰蛋白胨粉 10 g·L-1，酵母浸粉 5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，琼脂粉18 g·L-1。种子培养基:胰蛋白胨粉 10 g·L-1，酵母浸粉 5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1。

以上培养基均用蒸馏水配置，pH值调节为7.0～7.5，121 ℃高压灭菌20 min。

固体基础培养基:黄豆粉1 000 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·H2O 0.2 g，CaCl20.3 g,蒸馏水1 000 mL，调节pH值为7.0，121 ℃高压灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 基质预处理 用微型植物粉碎机将黄豆与豆粕粉碎(筛孔为1 mm)，将玉米秸秆粉碎至颗粒规格约为1 mm×10 mm。采用自动定氮仪测得黄豆与豆粕中蛋白质的含量。

1.2.2 菌种培养 将保存在4 ℃条件下的试管菌种挑取一环转接入菌种培养基(100 mL·瓶-1)，37 ℃，180 r·min-1培养12 h。

1.2.3 固体发酵基质成分的优化 固体基础培养基中黄豆粉分别替换为豆粕、m(豆粕)∶m(甘油)=4∶1、m(黄豆粉)∶m(豆粕)=1∶1 4种搭配充当主要发酵底物，其它条件一致。以500 mL三角瓶为反应器，每瓶中添加发酵底物20 g，每组试验设3个平行。将培养好的种子液按8%的接种量转接入固体培养基，充分混匀后封口放入恒温培养箱，37 ℃培养3 d，发酵完毕后测定聚谷氨酸的产率。

1.2.4 辅料以及添加最佳比例选择 分别设定发酵基质中黄豆粉与麸皮(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)黄豆粉与玉米秸秆(20∶1、20∶2、20∶3、20∶4、20∶5)的不同比例，接种后37 ℃恒温培养3 d，测定聚谷氨酸的产率，分别确定在发酵底物中麸皮和秸秆的最佳量。

1.2.5 固体发酵条件优化 以玉米秸秆为辅料，选择发酵条件含水率(50%、55%、60%、65%、70%)，初始pH值(5、6、6.5、7、7.5、8、9)，温度(27、31、34、37、40、44 ℃)进行单因素试验，筛选出最佳发酵条件。

1.2.6 提取与纯化 在发酵结束的三角瓶中加入定量的蒸馏水，搅拌均匀后放入180 r·min-1摇床内持续震荡2 h，用纱布过滤提取2～3次，然后合并提取液，6 000 r·min-1离心30 min，取一定量的上清液加4倍体积冷却无水乙醇，低温过夜沉淀。-80 ℃冷冻干燥后得到聚谷氨酸粗制品。将粗制品溶入一定量的蒸馏水中，再次乙醇沉淀干燥可得纯度更高的聚谷氨酸[8]。

1.2.7 聚谷氨酸含量测定 采用HPLC氨基酸柱前衍生测定聚谷氨酸含量。

1.2.7.1 提取物水解:精确称取提取物50 mg到水解管中,并注入浓度为6 mol·L-1的盐酸10 mL 酒精喷灯封口，110 ℃水解24 h，冷却后用6 mol·L-1的NaOH溶液调pH值至9.0后移至50 mL容量瓶中。用超纯水洗涤3次，定容，过滤后取滤液进行柱前衍生后，用反相高效液相色谱法分析L-谷氨酸含量。

1.2.7.2 柱前衍生:精确量取L-谷氨酸标准液400 μL于离心管中，分别加入稀释后的衍生剂A液和B液各200 μL后混匀，在50 ℃水浴锅中加热45 min后取出，冷却至室温后加入400 μL正己烷混匀，并用孔径为0.45 μm有机膜过滤，放置30 min后取澄清的下层液进行高效液相色谱分析。样品与标准品衍生方法相同。

1.2.7.3 色谱条件为色谱柱：Ultimate Amino acid，5 μm，4.6×250 mm；流动相A∶V(0.1 mol·L-1醋酸钠溶液pH值6.5)∶V(乙腈)=93∶7，流动相B∶V(水)∶V(乙腈)=20∶80，流动相梯度洗脱程序见表1。柱温：37 ℃，流速：1 mL·min-1，检测波长：254 nm，进样量：5 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2 结果与分析

2.1 固体发酵基质成分与辅料配比的选择

2.1.1 固体发酵基质成分的选择 利用自动定氮仪测得黄豆与豆粕中蛋白质含量分别为374.9 mg·g-1和433.7 mg·g-1。将黄豆粉碎可以大大增加微生物与发酵基质的接触面积，从而使发酵基质得到更充分的利用。豆粕为大豆提取豆油后的一种副产品，因此在试验中设计添加一定比例的甘油作为补偿碳源，结果如表2所示。用黄豆粉单独充当发酵基质所得聚谷氨酸粗品的纯度以及最终产量均优于豆粕、豆粕∶甘油以及豆粕∶黄豆粉，因此选择黄豆粉为最佳发酵底物。

2.1.2 辅料以及添加最佳比例选择 粉状基质与水混合后极易结块，颗粒间空隙率降低。聚谷氨酸产生菌为好氧微生物，适量添加起疏松作用的辅料可以增加固体基质的透气性，从而提高微生物代谢能力，提高代谢物的产量[9]。麸皮与秸秆是固态发酵中常用的基质，透气性好且成本较低，是一种理想的发酵基质。由图1-A、图1-B可知，随着麸皮和秸秆添加比例增大，聚谷氨酸的产量也增加。当豆粉与麸皮比例为7∶3时，聚谷氨酸产量为132.24 g·kg-1。而随着麸皮添加比例继续增大，聚谷氨酸的产量反而下降，因此，黄豆粉与麸皮最佳比例为7∶3。当黄豆粉与秸秆比例为20∶3时，聚谷氨酸产量最高，随着秸秆量的增加，聚谷氨酸的产量并没有随之增多，因此20∶3为黄豆粉与秸秆的最佳比例，此时聚谷氨酸的产量为145.79 g·kg-1。

表2 不同基质对γ-PGA产量的影响Table 2 Effect of different substrates on γ-PGA production

WP:黄豆粉，WB:麸皮，WS:秸秆。

2.2 固体发酵条件对聚谷氨酸产量的影响

2.2.1 初始含水率的优化 水分是微生物代谢过程中很大的影响因素之一。过低的含水率会严重影响菌体的生长繁殖,甚至引起微生物菌体休眠，而过高的含水率则会影响固体发酵基质的透气性，影响微生物菌体对氧气的利用[10]。秸秆吸水性很强，因此选择含水率为50%、55%、60%、65%、70%进行试验，结果如图2所示。从图2可以看出，含水率过高或过低都会影响聚谷氨酸的产量，最佳含水率为60%。

2.2.2 初始pH值的优化 pH值决定了发酵基质中各物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收和利用。前期试验发现解淀粉芽孢杆菌YP-B-2在过酸或过碱的条件下均不能生长。故试验选择初始pH值为(5、6、6.5、7、7.5、8、9)进行发酵培养，结果如图3所示。从图3可以看出，初始pH值为7～8时，聚谷氨酸的产量均较高，因此选择初始pH值为7～7.5。

图2 含水率对γ-PGA产量的影响Fig.2 Effect of moisture content on γ-PGA production

图3 初始pH值对γ-PGA产量的影响Fig.3 Effect of pH value on γ-PGA production

2.2.3 培养温度与周期的优化 微生物的一系列生化反应需要多种酶的催化才能完成，而温度是影响酶的催化速率的一个重要因素。从图4可以看出,温度为27 ℃时，聚谷氨酸产生的速率特别缓慢，而发酵温度为44 ℃时，聚谷氨酸产生的速率前期相对较快，48 h时产量达到最高，但远远低于其它温度条件下的终产量，随着时间推移产量急剧下降。发酵过程中随着温度升高γ-PGA最高产量持续增加，当温度为37 ℃时γ-PGA产量达到最高，为146.37 g·kg-1。随着温度继续的升高γ-PGA的产量明显下降，因此选择37 ℃为最佳发酵温度，发酵周期时间为64 h。

图4 温度与周期对γ-PGA产量的影响Fig.4 Effect of temperature and period on γ-PGA production

3 结论与讨论

本研究针对聚谷氨酸固体发酵培养基质问题，选择不同的发酵基质为研究对象，通过对其进行最优搭配，优化发酵条件，提高聚谷氨酸的产量，降低固体发酵成本。相对于液体深层发酵，固体发酵工艺可控性较差，因此优化固体发酵工艺、降低成本、提高产品得率应该主要从发酵原料方面着手[11]。本研究选择黄豆粉和豆粕为发酵基质，试验结果表明，即使在豆粕中添加甘油充当碳源，以豆粕为发酵基质所得产物得率也远远少于黄豆粉。因此选择黄豆粉为最佳发酵底物。解淀粉芽孢杆菌YP-B-2为好氧细菌，纯豆粉与水混合后极易结块，因缺乏氧气只有表面的发酵基质能够正常生长代谢。如果能选择合适的辅料，增加发酵过程中基质的透气性，不仅使微生物可以快速生长繁殖代谢，发酵底物可以得到充分利用，而且可以省去发酵过程中翻曲通气的人力和物力。麸皮和秸秆为常见的固体发酵基质，它们不仅可以增加发酵基质的透气性，而且可以充当一部分发酵基质[9]。本研究选择麸皮和秸秆2种辅料进行固体发酵，试验结果显示，麸皮和秸秆均能显著提高聚谷氨酸的产量，而从物理性质以及成本上来评估，秸秆支撑的反应结构透气性更好、成本更低。

水分作为发酵原料的另一大组成成分，也是影响微生物代谢效率的重要因素，所有的生化反应都是在水环境(或称水溶液)中进行。在聚谷氨酸固体发酵过程中，水分含量过低则会严重阻遏微生物的生理代谢反应，如果水分含量过高，随着基质中聚谷氨酸的含量增加，粘度也迅速增加，基质透气性也会大大减弱[12]，而且发酵基质湿度过高还会使基质易染杂菌，影响产量，因此选择合适的含水量也是保证发酵产品稳定的一个重要因素。微生物代谢环境的pH值同样会直接影响微生物的代谢反应，发酵基质的酸碱性决定了底物的离子化程度，从而影响微生物细胞对各营养物质的吸收利用。发酵过程中pH值较难控制，固体基质的特性对基质的酸碱性具有一定的缓冲作用，因此只需控制固体基质初始pH值即可[13,14]。本试验结果显示，最终选择固体发酵基质最优搭配为黄豆粉∶秸秆为20∶3、含水率60%、最佳pH值7～7.5、发酵温度37 ℃、发酵周期64 h。

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(责任编辑：朱秀英)

Optimization of substrates and process parameters for Poly-γ-glutamic acid solid-state fermentation

LI Wenjie， WANG Jie， WANG Pengju， ZHAO Xiaohang， WU Kun

(College of Life Sciences，Henan Agricultral University，Zhengzhou 450002，China)

Different dosages of fermentation matrix were investigated to obtain the optimal collocation. Through the optimization of solid-state fermentation conditions, the product of poly-γ-glutamic acid was improved and the cost of solid fermentation was reduced. When using soybean powder as the main fermentation substrate it had the highest yield of poly-γ-glutamic acid. By adding supplementary substrate, such as bran and straw, the yield was increased to 132.24 g·kg-1and 145.79 g·kg-1, respectively. So, straw was selected as supplementary substrate to optimize the fermentation conditions. After optimizing, the fermentations condition were as follows: initial medium pH7.0～7.5, moisture content 60%, temperature 37 ℃, fermentation period 64 h.

solid-state fermentation;B.amyloliquefaciens; poly-γ-glutamic acid; soybean powder; straw;bran

2014-10-02

河南省科技攻关重点项目(122102110120)

李文杰(1989-)，女，河南新乡人，硕士研究生，主要从事环境微生物方面的研究。

吴 坤(1963-)，男，河南驻马店人，教授，博士。

1000-2340(2015)02-0239-05

Q393.11

A