AQP-8和Caspase7在羊水过少孕妇胎膜组织中的表达

李小琴，解雁飞

(延安大学附属医院产科，陕西 延安716000)

AQP-8和Caspase7在羊水过少孕妇胎膜组织中的表达

李小琴，解雁飞

(延安大学附属医院产科，陕西 延安716000)

目的 探讨水通道蛋白-8(AQP-8)和凋亡蛋白Caspase7在羊水量过少产妇和羊水量正常的产妇胎膜中的表达差异。方法 采用免疫组化方法(SP法)分别检测30例羊水量过少实验组和30例羊水量正常对照组产妇胎膜组织中AQP-8和Caspase7的蛋白表达水平，并分析这两种蛋白的表达强度。结果 AQP-8和Caspase7蛋白在实验组与对照组产妇的胎膜中均有阳性表达。实验组胎膜中的AQP-8蛋白表达水平明显比对照组低，Caspase7的表达却明显比对照组高，而两者的表达差异均有统计学意义(t值分别为4.56、2.60，均P<0.05)；同时AQP-8与Caspase7在实验组胎膜细胞中的表达却呈负相关(r=-0.66，P<0.05)。结论 羊水量过少孕妇胎膜中AQP-8蛋白的低表达与Caspase7蛋白的高表达，提示AQP-8和Caspase7在产妇胎膜中的异常表达可能是羊水过少发生的原因之一。

羊水过少；胎膜；水通道蛋白；凋亡蛋白；免疫组织化学

临床上将妊娠晚期(妊娠期超过28周)羊水量少于300mL者称为羊水过少[1]。羊水过少是妇产科常见的妊娠合并症，可明显使孕妇剖宫产率增高，同时增加了围生儿的患病率和死亡率。羊水过少会使宫缩时子宫与胎儿之间的缓冲减少，脐带也容易受压，使胎儿发生宫内缺氧率大大增加[2]；同时羊水过少可使肺的膨胀减小，从而阻碍肺的发育，使新生儿窒息率增加[3]。目前仍有一部分羊水过少的病因尚不明确，因此通过研究羊水平衡的调控对预防、诊断和治疗羊水过少有着重要意义。

近年来，水通道蛋白(aquaporin，AQP)与凋亡蛋白Caspase在孕妇胎盘胎膜上的分布及其与羊水量调节关系的研究已渐渐引起国内外学者的重视。AQP作为跨膜转运水分子的通道之一，可能参与孕妇体内的羊水平衡调控，参与母胎之间的液体交换；Caspase7作为一种凋亡效应Caspase，是细胞凋亡途径中关键蛋白酶，也是细胞凋亡途径中蛋白酶联反应的必经之路，其在孕妇胎盘胎膜细胞中的正常表达能确保其正常有序的凋亡，从而维持着母胎之间的物质交换，保证胎儿的正常发育。因此，本研究通过运用免疫组化的方法检测AQP-8和Caspase7在羊水量正常和羊水过少孕妇胎膜中的表达差异及其相关性，进一步探讨羊水过少的病因。

1 对象和方法

1.1 研究对象

随机选择2013年6至11月在延安大学附属医院产科住院的足月孕(37～41周)择期剖宫产分娩的羊水量正常产妇30例为羊水量正常对照组；随机选取同期在延安大学附属医院产科住院的足月孕(37～41周)剖宫产分娩的羊水量过少产妇30例为羊水量过少实验组。诊断标准以谢幸主编的《妇产科学》(2013年第8版)为准。

此外，两组均排除合并妊娠期高血压疾病、胎膜早破、胎儿窘迫、胎儿宫内生长受限、胎儿畸形及其他并发症，无药物服用史，无缩宫素引产史及母体脱水等因素。本研究得到本院伦理委员会的支持，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 标本的采集和选择

常规消毒铺巾下，行子宫下段剖宫产术，在胎盘娩出后10min内分离胎盘胎膜组织，力求保持组织新鲜，勿使其干燥，取胎膜约2.0cm×2.0cm大小，将胎膜标本置于0.9%的生理盐水中漂洗3次，去除血凝块及血液，置于4%的多聚甲醛缓冲固定液中固定并编号。固定后充分水洗已固定的胎膜标本，以减少固定液造成的人为假象，并将其置于已标号的组织盒中盖紧，于全自动脱水机中常规酒精脱水。行石蜡包埋组织块，浸蜡。

1.3 研究方法及结果判定

1.3.1 免疫组化方法

1.3.1.1 石蜡组织的处理 取出已制备好并保存在冰箱中的石蜡组织块，并请延安大学附属医院病理科的资深切片专家连续切片2张。用多聚赖氨酸粘附载玻片将组织薄片固定并标记后，将切片依次置入二甲苯中脱蜡、梯度酒精中水化、蒸馏水洗冲。最后用已配制好的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，将切片置于耐高温染色架后放入蒸馏水中，防止切片干燥，以待抗原修复。

1.3.1.2 本实验操作步骤 严格按照抗体说明书进行：①根据第一抗体的要求，对胎膜组织进行抗原热修复；②消除内源性过氧化物酶活性。向免疫组化染色孵育盒底添加少量蒸馏水，将切片依次置入孵育盒里，然后向切片上的组织快速滴加过氧化氢溶液，将孵育盒盖严后置入37℃恒温培养箱中孵育20min，然后取出孵育盒，将切片用PBS冲洗；③滴加一抗抗体稀释液。按照说明书将0.1mL的蒸馏水分别加入兔抗人AQP-8抗体及兔抗人Caspase7抗体(冻干粉)中，溶解混匀后制备成抗体原液，随后配制一抗抗体稀释液(抗体原液与PBS的比例为1:300)。向切片上的组织快速滴加适量的一抗抗体稀释液后，室温下孵育60min后，PBS缓冲液冲洗；④滴加二抗。将切片放置在免疫组化孵育盒上，向切片快速滴加二抗，置于室温下孵育20min后，用PBS缓冲液冲洗；⑤显色液(DAB)显色。将切片放置在免疫组化孵育盒上，向切片依次快速滴加适量已配制好的新鲜DAB显色试剂，室温下染色约3～5min后蒸馏水冲洗终止显色；⑥复染、脱水、透明及封片。将切片置入苏木素染液中进行复染，把复染后的组织切片依次放入梯度酒精中脱水，二甲苯中透明，最后滴加中性树胶的同时加载盖玻片封片并粘贴标签。

1.3.2 结果的判定

以镜下在细胞内看到棕色或黄色颗粒者作为判定阳性细胞的标准。每张切片在高倍镜(×400)下随机选取5个视野，观察所选择视野中的所有细胞，同时记录阳性细胞百分数(阳性细胞百分数=阳性细胞数/计算的胎膜细胞数)，然后计分(P)：0分为<5%的胎膜滋养细胞呈阳性；1分为5%～10%的胎膜细胞呈阳性；2分为11%～50%的胎膜细胞呈阳性；3分为>50%的胎膜细胞呈阳性。同时对多数阳性细胞呈现的棕黄色计分(I)：3分为强着色；2分为中等着色；1分为浅着色。最终的结果为组织学积分(H)=P+I。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜组织中的表达定位

本研究通过用免疫组化实验方法检测AQP-8、Caspase7蛋白在两组产妇胎膜组织中的表达，结果显示AQP-8、Caspase7蛋白在两组产妇的胎盘和胎膜组织的细胞中均有阳性表达，呈棕黄色，其阳性表达部位主要分布于胎膜上皮细胞的细胞膜和胞浆中。AQP-8蛋白在羊水过少患者胎膜组织中表达呈弱阳性，同时在正常孕产妇的细胞中呈中度阳性表达，见图1、图2；Caspase7在羊水过少患者胎膜上皮细胞中呈中度阳性表达，而在正常孕产妇的细胞中呈弱阳性表达，见图3、图4。

图1 羊水过少患者胎膜中AQP-8的表达

Fig.1 The expression of AQP-8 in membranes of patientswith oligohydramnio

图2 正常产妇胎膜中AQP-8的表达

Fig.2 The expression of AQP-8 in membranes of normalpuerpera

图3 羊水过少患者胎膜中Caspase7的表达

Fig.3 The expression of Caspase7 in membranes of patients with oligohydramnios

图4 正常产妇胎膜中Caspase7的表达

Fig.4 The expression of Caspase7 in membranes of normal puerpera

2.2 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜组织中的表达比较

AQP-8和Caspase7在两组孕产妇胎膜组织中阳性表达部位主要分布于胎膜上皮细胞的细胞膜和胞浆中。经两样本比较的t检验分析得出：实验组的AQP-8蛋白表达水平低于对照组(P<0.05)，而实验组孕产妇胎膜细胞中的Caspase7表达水平高于对照组(P<0.05)，差异均有统计学意义，见附表。因此可以认为孕产妇发生羊水过少与胎膜细胞中AQP-8的低表达及Caspase7的高表达有关。

Table Comparison of histologic integral of AQP-8 and Caspase7 expression in membranes

2.3 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜组织中的表达关系

经Spearman等级相关分析后发现：正常对照组孕产妇胎膜上皮细胞中AQP-8与Caspase7表达的相关系数rs=0.14，P>0.05，差异无统计学意义；而在实验组rs=-0.66，P<0.05，差异有统计学意义，提示正常对照组孕产妇胎膜上皮细胞中AQP-8与Caspase7的表达并无相关性关系，而在实验组胎膜细胞中AQP-8与Caspase7的表达水平呈负相关。

3 讨论

3.1 水通道蛋白与凋亡因子

AQP从结构上而言是一种膜整合蛋白，可介导小分子物质快速被动跨膜转运。除转运水分子外，AQP-8还被发现可以转运嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物质，因此推测AQP-8参与了水和其它溶质由母体向胎儿的转运过程，决定羊水的膜内吸收途径。有学者研究发现，在一些肿瘤细胞中如肺癌、白血病细胞等也存在AQP-8[4-5]。缺氧诱导因子的表达增加后会使AQP的表达上调[6]。自Afire等在1988年发现AQP后，目前已在哺乳动物体内发现了13种AQP，它们统称为AQP家族(AQPs)。它们保持人体细胞内外环境的稳态，同时也参与机体部分重要的生理功能。

Caspase家族在细胞凋亡程序中起着关键性作用。细胞凋亡普遍存在于自然界，对于维持人体的稳定性和保证人体的正常发育均具有重要的意义。一旦体内的凋亡机制发生异常将引起多种疾病的发生。Caspase7即为半胱氨酸蛋白酶-7，是由303个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为35kd。作为Caspases家族中最重要的成员之一，Caspase7是细胞凋亡共同通路的效应分子，可诱导细胞凋亡。在正常情况下，Caspase家族介导的细胞凋亡途径有3种，但无论哪条通途，最终都汇合于效应Caspase(包括Caspase3、Caspase7)。Caspase7在细胞内通常以无活性的酶原形式存在，一旦被激活就启动凋亡程序，并以级联放大方式传导和放大凋亡信号，向下游凋亡执行因子传递，最终导致细胞凋亡。同时，Caspases之间还能相互激活，活化后的Caspase能特异性的识别底物，具有高度的特异性，保证了其在细胞凋亡程序中的专一性。胰岛素样生长因子可调控Cyt-C释放入胞质，从而抑制Caspase3引发的细胞凋亡[7-13]。

3.2 水通道蛋白、凋亡因子与羊水过少

孕妇胎盘胎膜上AQPs的表达及其与妊娠相关疾病关系的研究始于2000年，目前在孕妇胎盘或胎膜上仅发现有AQP-1、AQP-3、AQP-8和AQP-9的表达，暂时未发现其他AQP。为了解AQPs与羊水平衡的关系，Mann等(2006年)将AQP1基因敲除小鼠与正常小鼠相比，羊水量明显增加，故推测胎膜上的AQP1缺陷可能是导致原发性羊水过多发生的病因。同时，Zhu等[14]在研究原发性羊水过多的病因时，发现其羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞中的AQP-8表达较正常组有明显的升高。刘慧妹等[15]也运用RT-PCR检测了5例羊水过多胎膜组织中AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表达，发现羊水过多组孕妇胎膜中AQP-8 mRNA表达显著高于正常组。熊正方等[16]研究了5例正常和羊水过少孕妇的胎盘上AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表达，结果显示羊水过少组的胎盘组织中仅有AQP-8 mRNA表达显著低于正常组孕妇，这与Mann等的研究结果不一致。Yasui等(1997年)提出，对于AQPs调节羊水量的机制不仅与羊水的吸收有关，可能也与羊水的生成如胎肺分泌物有关。究竟AQPs是羊水量异常的病因，还是羊水量异常发生时的代偿机制，仍有待于进一步的研究。

正常孕妇的胎膜细胞在胎盘胎膜发育全过程中进行有序的细胞凋亡。Caspase7在正常妊娠胎膜绒毛滋养细胞的正常表达可以确保正常胎膜细胞的凋亡，维持着母胎之间的物质交换及胎儿的正常发育。当Caspase7的表达异常时可诱发细胞凋亡程序发生障碍，滋养细胞凋亡增加后，其细胞体积缩小，从而导致大多数滋养细胞表面的AQP失活，不再介导水分子的跨膜运动，细胞对羊水的通透性下降，从而导致妊娠羊水过少的发生。因此，如果Caspase的表达异常是引起羊水过少的发病机制，那Caspase可作为一种新的治疗羊水过少的手段。

本研究发现，在光镜下AQP-8和Caspase7蛋白在两组产妇胎膜细胞的细胞膜和细胞质中均有表达，在阳性细胞的细胞膜和细胞浆中均可见明显的棕黄色染色阳性颗粒。与正常对照组比较，实验组胎膜细胞中AQP-8蛋白的表达明显降低；而Caspase7的表达以中度及强阳性为主，升高明显，差异均有显著性(均P<0.05)。由此推测，在实验组孕妇胎膜细胞上Caspase7的表达影响AQP的结构和功能，会使AQP-8的表达下降，从而改变细胞对羊水的通透性，减少羊水膜内途径的重吸收，阻止过多的液体重吸收进入胎儿血循环，达到平衡羊水量的目的。

3.3 展望

本研究表明AQP-8及Caspase7蛋白在羊水过少孕妇的胎膜组织中表达异常，为母胎液体交换及羊水平衡的分子机制提供了理论依据，同时，为羊水过少的临床诊断及治疗提供了新的思路，进而改善临床最后的结局，最终降低剖宫产率、围生儿病率和死亡率，提高了围产医学质量。但是，AQP-8及Caspase7蛋白调节胎膜羊水量平衡的机制还有待进一步研究，以后期望通过扩大样本量进行多因素分析研究，来寻找羊水过少发生的生物学特性，进一步揭示其发生、发展的规律，为羊水过少的早预防、早诊断和早治疗提供新的思路。

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[专业责任编辑：杨文方]

Expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of pregnant women with oligohydramnios

LI Xiao-qin, XIE Yan-fei

(DepartmentofObstetrics,Yan’anUniversityAffiliatedHospital,ShaanxiYan’an716000,China)

Objective To explore the difference in expressions of aquaporin 8 (AQP-8) and Caspase7 in membranes of puerpera with oligohydramnios and of normal puerpera. Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of experimental group (n=30, puerpera with oligohydramnios) and of control group (n=30, normal pregnant women), and the expression strength was analyzed. Results The expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of two groups were positive. Compared with the control group, the expression of AQP-8 was lower and that of Caspase7 was higher in the experimental group, and the differences were significant (tvalue was 4.56 and 2.60, respectively, bothP<0.05). The expression of AQP-8 was negatively correlated with that of Caspase7 in the experimental group (r=-0.66,P<0.05).Conclusion The abnormal expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of puerpera may be one of the causes of oligohydramnios.

oligohydramnios；membranes；aquaporin(AQP)；Caspase7；immunohistochemistry

2014-11-03

李小琴(1973-)，女，副主任医师，主要从事产科临床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.017

R714.25

A

1673-5293(2015)03-0450-03