大蒜素对IgA肾病纤维化大鼠肾脏保护作用的研究

黄燕萍，王 祥，高 娜，赵文静，孙 艳，马丹萍，刘 丽

(1.西安交通大学第一附属医院儿科，陕西 西安710061；2.莱州市人民医院儿科，山东 莱州261400；3.陕西省人民医院，陕西 西安710068；4.西安市中心医院，陕西 西安710003)

大蒜素对IgA肾病纤维化大鼠肾脏保护作用的研究

黄燕萍1，王 祥2，高 娜3，赵文静4，孙 艳4，马丹萍1，刘 丽1

(1.西安交通大学第一附属医院儿科，陕西 西安710061；2.莱州市人民医院儿科，山东 莱州261400；3.陕西省人民医院，陕西 西安710068；4.西安市中心医院，陕西 西安710003)

目的 研究大蒜素对IgA肾病肾间质纤维化的影响，并探讨其可能的肾脏保护机制。方法 联合IgA肾病模型及单侧输尿管结扎的方法建立IgA肾病纤维化的动物模型。将SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组及高、低剂量大蒜素治疗组，按各组相应药物剂量灌胃。于干预前、干预14天及28天检测各组大鼠尿红细胞计数、尿素氮水平及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)含量；并于28天末光镜下观察各组大鼠肾脏的病理改变。结果 与模型对照组相比，高、低剂量大蒜素治疗组大鼠尿红细胞计数(模型组-高剂量组，干预14天/28天，t=1.12/5.58；模型组-低剂量组，干预14天/28天，t=1.62/7.51)、尿素氮水平、血清TNF-α(模型组-高剂量组，干预14天/28天，t=3.48/11.95；模型组-低剂量组，干预14天/28天，t=4.76/12.78)、α-SMA含量(模型组-低剂量组，干预14天/28天，t=5.38/5.77)均降低(均P<0.05)，肾小球系膜区IgA沉积强度明显减轻，肾组织病理纤维化程度亦有所减轻。大蒜素高、低剂量治疗组在降低尿红细胞计数(干预28天，t=1.99)、血清TNF-α(干预28天，t=3.73)和α-SMA(干预14天/28天，t=5.60/4.81)水平上差异均有统计学意义(均P<0.05)，以大蒜素低剂量效果稍好。结论 血清TNF-α和α-SMA在IgA肾病纤维化进展中进行性增高；大蒜素能够改善IgA肾病纤维化大鼠的临床症状、减轻肾脏病理学损害，可能通过降低血清TNF-α和α-SMA水平发挥抗肾脏纤维化的作用。

IgA肾病；肾间质纤维化；肿瘤坏死因子-α；α-平滑肌肌动蛋白

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是常见的原发性肾小球疾病之一，其病理特点是肾小球系膜区以IgA为主的免疫复合物沉积，常合并有系膜细胞增生、基质增多的组织学改变。以往认为儿童期发病者预后良好，但近年研究发现在确诊后的5～25年内，约9%～50%的患者呈进行性发展，不可逆转地进展为终末期肾病，而肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是其主要病理学特征。

IgA肾病RIF的发生机制十分复杂，其中，多种细胞因子在肾纤维化中的相互作用越来越得到学者们的关注。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)既往作为炎症因子被广泛研究，目前发现TNF-α能影响多种正常细胞的生长及分化，并刺激成纤维细胞的增殖，在组织纤维化的发生发展中发挥重要的调节作用。α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)是真核细胞的一种细胞骨架蛋白，也是肌成纤维细胞的标志性蛋白。Badid等[1]诸多学者认为α-SMA可能是预测肾脏纤维化进展的理想指标。本实验旨在建立IgA肾病纤维化大鼠模型，以TNF-α及α-SMA为实验指标，研究大蒜素对IgA肾病RIF的影响，并探讨其可能的抗肾脏纤维化作用。

1 实验材料和方法

1.1 动物的选择

健康、雌性、清洁级SD大鼠32只，鼠龄为6周左右，体重在160～180g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，适应性饲养1周。

1.2 药品与试剂的选择

大蒜素胶囊(20mg/粒，批号：120607)、牛血清白蛋白(美国Amresco公司)、脂多糖(美国Sigma公司)、正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗大鼠IgA抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG抗体、TNF-α及α-SMA ELISA试剂盒(96T/盒，北京博奥森生物技术有限公司，批号：120829)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模

联合IgA肾病模型及单侧输尿管结扎的方法建立IgA肾病纤维化的动物模型。牛血清白蛋白(400mg/kg)自实验第1天起，隔日灌胃，持续9周；四氯化碳(0.1mL/只)自实验第1周末起，皮下注射，每周1次，持续9周；脂多糖(0.05mg/只)于实验第6、8周末，尾静脉注射。9周末用5%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿左侧腹切口(1～2cm)暴露分离左侧输尿管，结扎并剪断输尿管近肾盂段，缝合切口。术后常规予青霉素抗感染治疗3天。

1.3.2 实验分组及用药

随机选8只作为正常对照组，剩余大鼠进行IgA肾病纤维化造模。建模成功后再随机分为模型对照组、高剂量大蒜素治疗组及低剂量大蒜素治疗组，每组8只。其中，正常对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃；高、低剂量大蒜素治疗组分别给予大蒜素胶囊溶液(60mg/kg)和大蒜素胶囊溶液(40mg/kg)灌胃，每日1次，持续28天。

1.3.3 标本收集

分别于干预前、干预14天及干预28天观察大鼠的一般情况，收集大鼠尿液、血液以检测尿红细胞计数、尿素氮水平、血清TNF-α及α-SMA含量。干预28天末处死大鼠，取肾组织分别做普通光镜苏木精-伊红(HE)染色、三色胶原(Masson)染色及免疫荧光检查。采用间接免疫荧光法按照国内通用标准进行分级(5级)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 实验大鼠的一般情况

正常对照组大鼠一般情况良好，无明显改变。模型对照组及高、低剂量大蒜素治疗组大鼠在造模期间出现毛发蓬乱、活动量减少、精神萎靡等状况，大蒜素干预后两治疗组大鼠上述症状较前好转。干预期间，模型对照组及高剂量大蒜素治疗组各死亡大鼠1只，可能与术后切口感染及眼底静脉丛采血不当有关。

2.2 血清肿瘤坏死因子-α及α-平滑肌肌动蛋白的变化情况

与正常对照组相比，干预前、干预14天、干预28天，模型对照组及高、低剂量大蒜素治疗组大鼠血清TNF-α及α-SMA均明显升高(均P<0.05)。

①TNF-α：与模型对照组相比，干预14天及28天时，高、低剂量大蒜素治疗组大鼠血清TNF-α均明显降低，高、低剂量大蒜素治疗组均有显著性差异(均P<0.05)；干预28天时，高、低剂量大蒜素治疗组组间比较有显著性差异(P<0.05)，低剂量大蒜素治疗组降低血清TNF-α效果更明显(P<0.05)，见表1。

②α-SMA：与模型对照组相比，干预14天及28天时，高、低剂量大蒜素治疗组大鼠血清α-SMA均明显降低，低剂量大蒜素治疗组均有显著性差异(均P<0.05)，高、低剂量大蒜素治疗组组间比较亦有显著性差异(P<0.05)，低剂量大蒜素治疗组降低血清TNF-α效果更明显(P<0.05)，见表2。

2.3 临床指标变化情况

与正常对照组相比，模型对照组和高、低剂量大蒜素治疗组大鼠尿红细胞计数、尿素氮均明显升高(均P<0.05)。

①尿红细胞计数：与模型对照组相比，干预14天及28天时，高、低剂量大蒜素治疗组大鼠尿红细胞计数均明显降低，高、低剂量大蒜素治疗组均有显著性差异(均P<0.05)；干预28天时，高、低剂量大蒜素治疗组组间比较有显著性差异(P<0.05)，低剂量大蒜素治疗组降低尿红细胞计数效果更明显(P<0.05)，见表3。

组别例数(n)干预前t干预14天t干预28天t正常对照组813.18±3.59 13.57±3.74 13.35±2.65 模型对照组720.40±2.78★2.7447.33±4.43★14.1366.18±2.90★ 47.50高剂量大蒜素治疗组719.53.±3.41★2.2339.78±2.90★■16.06/3.4847.49±2.63★■26.43/11.95低剂量大蒜素治疗组821.76±1.92★3.6534.14±3.73★■11.02/4.7640.48±3.71★■◆15.12/12.78/3.73F11.7394.93354.64P0.000.000.00

注：★表示与正常对照组比较P<0.05，■表示与模型对照组比较P<0.05，◆表示与高剂量大蒜素治疗组比较P<0.05。

表2 血清α-SMA水平变化情况

注：★表示与正常对照组比较P<0.05，■表示与模型对照组比较P<0.05，◆表示与高剂量大蒜素治疗组比较P<0.05。

②尿素氮：与模型对照组相比，干预14天及28天时，高、低剂量大蒜素治疗组大鼠尿素氮均降低，高、低剂量大蒜素治疗组均无显著性差异(均P>0.05)，高、低剂量大蒜素治疗组组间比较亦无显著性差异(P>0.05)，见表4。

表3 尿红细胞计数变化对照情况

注：★表示与正常对照组比较P<0.05，■表示与模型对照组比较P<0.05，◆表示与高剂量大蒜素治疗组比较P<0.05。

表4 尿素氮变化对照情况

注：★表示与正常对照组比较P<0.05。

2.4 肾组织病理学改变情况

2.4.1 苏木精-伊红染色

正常对照组大鼠肾小球、肾小管大小形态正常；模型对照组大鼠肾小球肿胀明显，弥漫性系膜细胞及基质增生。肾小管萎缩、坏死明显，可见大量炎症细胞浸润；高、低剂量大蒜素治疗组改变类似，但与模型对照组相比，肾小球系膜细胞及基质增生有所缓解，肾小管萎缩塌陷及间质炎性细胞浸润程度有所减轻。

2.4.2 三色胶原染色

正常对照组大鼠肾间质染色较少；模型对照组大鼠肾小管结构破坏明显，间质染色明显增多，有大量胶原形成；高、低剂量大蒜素治疗组改变类似，但与模型对照组相比，蓝色面积染色减少，RIF的程度有所减轻，见图1。

图1 干预28天各组大鼠肾组织HE染色(左图)与Masson染色(右图)

Fig.1 Kidney tissues staining by HE(left) and Masson(right) at 28 days after intervention

2.4.3 肾组织IgA免疫荧光改变

正常对照组大鼠肾小球系膜区未见IgA沉积；模型对照组大鼠肾小球系膜区可见黄绿色团块状及颗粒状的IgA沉积，荧光较强；高、低剂量大蒜素治疗组大鼠系膜区亦有不同程度的IgA沉积，但荧光强度较弱，与模型对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)，但组间比较未见显著性差异(P>0.05)，见图2、表5。

图2 干预28天各组大鼠IgA沉积情况

Fig.2 IgA deposits of different groups at 28 days after intervention

表5 干预28天各组大鼠IgA免疫荧光定量

Table 5 IgA immunofluorescence quantitative of different groups at 28 days after intervention

2.5 实验大鼠各指标间的相关性

血清TNF-α、α-SMA与尿红细胞计数、尿素氮的相关性：①干预14天及28天，各组大鼠血清TNF-α与尿红细胞计数之间有显著正相关(均P<0.05)，相关系数rs分别为0.66、0.88；回归方程分别为Y=11.13X-89.07、Y=8.94X-69.31，其中，X为血清TNF-α，Y是尿红细胞计数；②干预14天及28天，各组大鼠血清TNF-α与血尿素氮之间有显著正相关(均P<0.05)，相关系数rs分别为0.73、0.63；回归方程分别为Y=0.18X+2.93、Y=0.10X+3.42，其中，X为血清TNF-α，Y是血尿素氮；③干预14天及28天，各组大鼠血清α-SMA与尿红细胞计数之间有显著正相关(均P<0.05)，相关系数rs分别为0.61、0.85；回归方程分别为Y=6.20X-433.93、Y=5.78X-398.77，其中，X为血清α-SMA，Y是尿红细胞计数；④干预14天及28天，各组大鼠血清α-SMA与血尿素氮之间有显著正相关(均P<0.05)，相关系数rs分别为0.56、0.61；回归方程分别为Y=0.10X-2.09、Y=0.07X-0.71，其中，X为血清α-SMA，Y是血尿素氮。

血清α-SMA与TNF-α的相关性：干预14及28天，各组大鼠血清α-SMA与TNF-α之间有显著正相关(均P<0.05)，相关系数rs分别为0.71、0.86；回归方程分别为Y=0.50X-24.62、Y=0.60X-31.29，其中，X为血清α-SMA，Y是血清TNF-α。

3 讨论

3.1 IgA肾病纤维化大鼠模型的建立

汤颖等[2]运用隔日口服牛血清白蛋白、皮下注射四氯化碳及静脉注射脂多糖的方法，建立了病理类型及临床指标均与人类IgAN颇为相似的动物模型。国内已经有学者成功地应用IgA肾病模型联合高脂饮食建立起IgA肾病血管病变的动物模型[3]以及应用IgA肾病模型联合单侧肾脏切除的方法建立起IgA肾病肾小球硬化模型[4]。本实验模型对照组大鼠均出现明显的血尿，伴尿素氮升高。大鼠肾脏病理学染色提示弥漫性系膜细胞及基质增生，肾小管萎缩、坏死明显，间质纤维化显著，可见大量炎症细胞浸润。免疫荧光下肾小球系膜区可见黄绿色IgA沉积，提示IgA肾病纤维化的大鼠模型建立成功。

3.2 大蒜素对IgA肾病纤维化大鼠肾脏保护作用

细胞因子调控失衡是肾组织纤维化的形成和发展的重要原因之一。TNF-α是一种由多种细胞产生的具有广泛生物学活性的细胞毒细胞因子，近年来发现TNF-α亦可刺激成纤维细胞增殖，对正常细胞的生长及分化有一定的调节作用，提示TNF-α可能是一种潜在的致纤维化因子。罗小良等[5]在研究大蒜素对脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡实验中发现，大蒜素能抑制牙周膜成纤维细胞TNF-α的分泌，进而促进成纤维细胞的凋亡。核因子-κB(NF-κB)是调节细胞基因转录的关键因子之一，多项研究显示TNF-α可激活NF-κB途径而介导多种炎症介质的转录与表达。张鹏等[6]在研究大蒜素对脓毒症大鼠脑保护作用的研究中发现，大蒜素能降低脓毒症大鼠脑组织中NF-κB值，进而降低脓毒症大鼠的血糖、谷丙(草)转氨酶及血尿素氮值，其可能的保护机制是否通过下调TNF-α水平而抑制NF-κB在肾组织的表达，有待后续的进一步研究。

曾玉兰等[7]在研究大蒜素对博莱霉素复制大鼠肝纤维化的实验中发现，大蒜素能降低肺组织内羟脯氨酸的浓度，其可能的保护作用与下调转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达，从而减少成纤维细胞α-SMA基因的表达有关。董正华等[8]在研究糖尿病肾病大鼠模型时发现，中药治疗组大鼠血清TNF-α水平及肾小管上皮细胞α-SMA表达均明显降低，提示降低TNF-α水平可能会延缓肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化。本实验结果显示模型对照组大鼠血清TNF-α、α-SMA水平明显增高，而大蒜素能够显著降低上述指标含量，提示大蒜素延缓RIF的作用可能与降低上述两者的水平而抑制细胞外基质沉积或者抑制肾小管上皮转分化有关。

α-SMA是肌成纤维细胞(MF)的标志性蛋白，转化后的MF既能大量合成间质胶原，又具有强大的收缩能力，引起肾脏结构的重塑，共同促进肾脏纤维化的发生。有研究提示组织中α-SMA的检测有助于了解肾小球或肾小管间质的病损程度，对慢性肾病的长期预后有一定的预测意义[9]。既往关于α-SMA的研究仅涉及肾脏组织中的表达，而肾脏穿刺作为一种有创检查，血清中α-SMA的测定更加凸显出意义。本实验结果显示模型对照组大鼠血清α-SMA在IgA肾病纤维化进展中进行性增高，且与尿红细胞计数、尿素氮及TNF-α均呈正线性相关，提示血清α-SMA测定可能是一种理想的替代物，可作为一种新的纤维化指标有助于IgA肾病RIF的诊断。

IgA肾病RIF是一个极其复杂的病理过程，是在多种致病因子作用下，多种效应细胞、细胞因子等共同作用的结果。本实验只检测了血清中TNF-α和α-SMA的含量，且关于血清中α-SMA的来源及去路不甚清楚，因此大蒜素抗RIF的作用机制有待进一步研究。

[1]Badid C, Mounier N, Costa A M,etal.Role of myofibroblasts during normal tissue repair and excessive scarring:Interest of their assessment in nephropathies[J].Histol Histopathol,2000,15(1):269-280.

[2]汤颖,娄探奇,成彩联,等.实验性IgA肾病模型的改进[J].中山大学学报,2006,27(2):184-187.

[3]邵健娜,张建荣.来氟米特对IgA肾病大鼠血管病变的保护作用[D].新乡:新乡医学院硕士学位论文,2012.

[4]黄国东,许健,姜云,等.复方仙草颗粒对IgA肾病肾小球硬化大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响[J].时珍国医国药,2010,21(11):2822-2824.

[5]罗小良,谢晓莉.大蒜素对脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡及IL-1β、TNF-α分泌的影响[D].长沙:中南大学硕士学位论文,2010.

[6]张鹏,曹农.大蒜素对脓毒症大鼠脑保护机制的探讨[D].兰州:兰州大学硕士学位论文,2014.

[7]曾玉兰,冷凡.大蒜素对肺纤维化大鼠肺组织α-SMA和TGF-β1表达的影响[J].中国现代医学杂志,2011,21(15):1814-1818.

[8]董正华,赵晓睿,马拯华,等.通络益肾滋阴方对糖尿病肾病大鼠血清TNF-α及肾小管上皮细胞α-SMA的影响[J].现代中医药,2009,29(2):58-61.

[9]周瑶,杨林.CKD患者肾组织α-SMA的表达与颈动脉内膜厚度的关系[D].石家庄:河北医科大学硕士学位论文,2014.

[专业责任编辑：古桂雄]

Protection function of tumor necrosis factor-α and α-smooth muscle actin in IgA nephropathy fibrosis

HUANG Yan-ping1, WANG Xiang2, GAO Na3, ZHAO Wen-jing4, SUN Yan4, MA Dan-ping1, LIU Li1

(1.DepartmentofPediatrics,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China; 2.DepartmentofPediatrics,LaizhouCityPeople’sHospital,ShandongLaizhou261400,China;3.ShaanxiProvincialPeople’sHospital,ShaanxiXi’an710068,China; 4.CentralHospitalofXi’an,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To study the influence of diallyl trisulfide on IgA nephropathy renal interstitial fibrosis and to explore its possible renal protective mechanism. Methods IgA nephropathy fibrotic model in rats were established in study by combining IgA nephropathy model with unilateral ureteral obstruction. The healthy SD rats were randomly and equally divided into 4 groups: normal control group, model control group, high-dose dially trisulfide (DATS) treatment group and low-dose DATS treatment group. The above groups were lavaged with corresponding drug. The urine and blood of rats were examined for urinary red blood cell count, blood urea nitrogen, TNF-α and α-SMA before intervention, 14 and 28 days after intervention. At the 28th day, all rats were sacrificed and their pathomorphological changes in kidneys were observed by immune fluorescence microscope. Results Compared with model control group, the levels of urine erythrocyte (model control group —high-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=1.12/5.58; model control group— low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=1.62/7.51), blood urea nitrogen, TNF-α (model control group—high-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=3.48/11.95; model control group —low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=4.76/12.78) and α-SMA (model control group—low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=5.38/5.77) reduced in both DATS treatment groups. The degree of IgA deposits at glomerular mesangial area and the renal pathological fibrosis relieved in both DATS treatment groups. There were significant differences between high-dose and low-dose DATS treatment groups in reducing the levels of urine erythrocyte (at 28 days after intervention,t=1.99), TNF-α (at 28 days after intervention,t=3.73) and α-SMA (at 14/28 days after intervention,t=5.60/4.81) (allP<0.05). The effect of low-dose DATS treatment was more obvious.Conclusion The levels of TNF-α and α-SMA increase progressively in IgA nephropathy fibrosis developing. The dially trisulfide can relieve the clinical symptoms and pathological damages in IgA nephropathy fibrotic rats, and can prevent the occurrence of renal interstitial fibrosis by reducing the levels of serum TNF-α and α-SMA.

IgA nephropathy (IgAN)；renal interstitial fibrosis (RIF)；tumor necrosis factor-α (TNF-α)；alpha smooth muscle actin (α-SMA)

2014-07-11

黄燕萍(1963-)，女，教授，博士，主要从事小儿肾病的临床与基础研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.007

R392

A

1673-5293(2015)03-0418-05