苦参碱联合顺铂对SiHa细胞TSLC1基因表达的影响

梁 欢，郭冠荣

(湖北省恩施土家族苗族自治州民族医院妇产科，湖北 恩施 445000)

苦参碱联合顺铂对SiHa细胞TSLC1基因表达的影响

梁 欢，郭冠荣

(湖北省恩施土家族苗族自治州民族医院妇产科，湖北 恩施 445000)

目的 探讨苦参碱联合顺铂抑制人宫颈癌SiHa细胞及对肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因表达的效果。方法 取对数生长期的SiHa分为对照组、苦参组、顺铂组和联合组，采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定4组联合干预SiHa细胞2d后的抑制率；采用实时荧光定量(RT-PCR)技术检测各组处理后TSLC1基因mRNA表达水平的变化。结果 对照组、顺铂组、苦参碱组和联合组的SiHa细胞抑制率分别为0、61.24%、70.31%和74.20%，药物干预组均高于对照组(t值分别为14.21、17.44、11.20，均P<0.05)，同时联合组高于苦参碱和顺铂单独干预(t值分别为4.47、3.21，均P<0.05)，而顺铂和苦参碱组间差异无统计学意义(t=0.71，P>0.05)。对照组、苦参碱组、顺铂组和联合组干预SiHa细胞后TSLC1mRNA表达量分别为1.00±0.00μg/mL，23.53±0.01μg/mL，84.33±0.03μg/mL和90.23±0.01μg/mL，苦参碱组、顺铂组和联合组干预组明显高于对照组(z值分别为9.41、10.72、13.23，均P<0.05)，其中苦参碱组和联合组TSLC1mRNA表达量组间比较差异无统计学意义(z=1.24，P>0.05)，但均高于顺铂组(z值分别为6.04、5.47，均P<0.05)；析因设计方差分析结果表明顺铂和苦参碱均为SiHa细胞抑制率和TSLC1基因表达的影响因素，而且两者存在交互作用，联合应用使效果增加。结论 苦参碱联合顺铂能抑制人宫颈癌SiHa细胞增殖，提高TSLC1mRNA表达量。

宫颈癌；SiHa细胞；苦参碱；顺铂；肺癌肿瘤抑制因子1

宫颈癌(cervical carcinoma)是妇科较为常见的恶性肿瘤之一，我国宫颈癌粗发病率为87/10万，粗死亡率为20/10万，均呈逐年上升的趋势[1-2]。基础研究表明，宫颈癌的发生和发展涉及多种癌基因的激活、抑癌基因的失活。肺癌肿瘤抑制基因-1(tumor suppressor in lung cancer-1,TSLC1)在宫颈癌组织中表达降低或缺失，与癌组织的转移密切相关，因此成为宫颈癌治疗的热点领域[3]。顺铂是宫颈癌化疗使用最广泛的药物，而苦参碱作为一种具有潜在临床价值的抗肿瘤中药，对宫颈癌细胞也具有抑制增殖作用，刘畅[4]认为苦参碱联合顺铂能抑制人宫颈癌SiHa细胞生长，机制可能与TSLC1mRNA表达上调有关。本研究尝试进一步探讨苦参碱联合顺铂对人宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响，为宫颈癌治疗提供更充足依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人宫颈癌SiHa细胞株由武汉大学提供，药物与试剂包括：顺铂(国药准字H20043889，规格为6mL:30mg)，苦参碱(国药准字H20045238，规格为5mL:50mg)，TSLC1基因及β-肌动蛋白(β-actin)引物，四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，普朗品牌9602系列酶标仪。人宫颈癌SiHa细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，温度37℃，5%CO2饱和湿度，2～3d传代1次。

1.2 方法

1.2.1 细胞抑制率

取对数生长期的SiHa细胞，经0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化传代后计数，将细胞密度调整为6×104/mL并以每孔100μL接种于96孔板，大部分细胞贴壁后分为对照组、苦参组、顺铂组和联合组。对照组加入SiHa细胞液和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液，苦参碱组加入苦参碱至终浓度为250μg/mL，顺铂组加顺铂至终浓度为15μg/mL，联合组加入250μg/mL苦参碱和15μg/mL顺铂。每组设6个平行孔，继续培养2d，各组每孔加入5mg/mL的MTT10μL，继续孵育4h，小心吸去各个孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，200μL)使结晶物充分溶解，振荡15min，酶标仪测定OD490nm处吸光光度值(A值)。对照组细胞活力为100%，计算各干预组对SiHa细胞增殖的抑制率，细胞抑制率(%)=(1-观察组吸光度/对照组吸光度)×100%[4]。

1.2.2 肺癌肿瘤抑制基因-1mRNA的相对表达量

采用实时荧光定量(real-time fluorescence quantification，RT-PCR)技术检测经药物处理后TSLC1基因mRNA表达水平的变化。首先取各组对数生长期SiHa细胞，使用RNAisoTM Plus按照试剂盒说明书提取总RNA，取RNA以10μL体系进行逆转录，制备cDNA，并释放30倍备用。RT-PCR扩增仪检测TSLC1mRNA相对表达定量。PCR扩增反应条件：95℃30s(预变性)，95℃5s，60℃30s，40个循环后终止。结果运用RT-PCR 仪自带软件Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1 进行数据分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组抑制率和mRNA表达结果

对照组、顺铂组、苦参碱组和联合组的SiHa细胞抑制率均高于对照组(t值分别为14.21、17.44、11.20，均P<0.05)，同时联合组高于苦参碱和顺铂单独干预(t值分别为4.47、3.21，均P<0.05)，而顺铂和苦参碱组间差异无统计学意义(t=0.71，P>0.05)。3组药物干预后TSLC1mRNA表达量明显高于对照组(z值分别为9.41、10.72、13.23，均P<0.05)，其中苦参碱组与联合组TSLC1mRNA表达量组间比较差异无统计学意义(z=1.24，P>0.05)，但均高于顺铂组(z值分别为6.04、5.47，均P<0.05)，见表1和附图。

表1 各组A值及抑制率

注：A：对照组；B：顺铂组；C：苦参碱组；D：联合组。

附图 相差倒置显微镜观察SiHa细胞在不同组别中的变化

Fig. Variation of SiHa cells in different groups observed by inverted microscope

2.2 不同干预措施对抑制率和mRNA表达的影响

对影响SiHa细胞抑制率和TSLC1mRNA表达的因素进行析因设计方差分析，结果显示，抑制率和mRNA表达均受到顺铂和苦参碱影响，而两种干预措施之间存在明显交互作用，联合使用时效果增强，见表2。

表2 A值和TSLC1 mRNA表达水平析因设计方差分析结果

3 讨论

3.1 肺癌肿瘤抑制基因-1与宫颈癌的关系

宫颈细胞的恶性转化、侵袭以及转移能力获得是一个逐渐演变的过程，目前认为与原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活有关。TSLC1基因是最初在肺癌中发现的抑癌基因，在多种恶性肿瘤包括宫颈癌组织中表达缺失，说明其与肿瘤的发生、发展和转移均密切相关[5]。TSLC1编码一种细胞黏附分子，不仅与抑癌蛋白相结合发挥抑癌作用，而且还参与细胞间的粘附作用和细胞间的信号转导，对肿瘤细胞周期进行负调控，从而抑制宫颈癌的发生和发展[6-7]。

3.2 顺铂和苦参碱治疗宫颈癌的进展

顺铂是铂的金属络合物，通过破坏癌细胞DNA复制而发挥细胞毒作用。近年来研究证实，宫颈癌对顺铂治疗较为敏感，以顺铂为基础的联合放化疗对晚期及复发性宫颈癌疗效确切[8]。苦参碱是我国传统中药苦参中提取出的一种主要活性成分，具有消炎抗菌、抗过敏、抗心率失常等多种药理学作用，而目前的研究热点集中于其抗肿瘤作用及其机制[9]，其可以通过丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路抑制真核细胞起始因子4E的磷酸化，从而抑制体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖[10]。研究显示，苦参碱能够增加SiHa细胞对顺铂的敏感性，而两者均可以通过上调TSLC1的表达，起到对人宫颈癌SiHa细胞的抑制作用，进一步影响宫颈癌的发生、发展和转移[4,11]。

3.3 苦参碱联合顺铂对SiHa细胞肺癌肿瘤抑制因子1基因表达的影响

本研究结果显示，顺铂和苦参碱均能有效抑制宫颈癌SiHa细胞和上调TSLC1基因的表达，而且两者存在协调作用，联合使用时疗效增加，进一步印证了苦参碱能够增加SiHa细胞对顺铂的敏感性。TSLC1基因甲基化是导致基因失活的重要机制，而TSLC1基因甲基化频率在宫颈癌组织、子宫颈上皮内瘤变组织、慢性炎症组织中分别为66.2%、43.3%、6.9%，提示与宫颈癌的发生密切相关[12]，但上调TSLC1基因的表达是否有助于活体肿瘤细胞的控制，有待临床研究证实。

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[3]Huang Y,Song H,Hu H,etal.Trichosanthin inhibits DNA methyltransferase and restores methylation-silenced gene expression in human cervical cancer cells[J]. Mol Med Rep,2012,6(4):872-878.

[4]刘畅,张煦,魏敏,等.苦参碱联合顺铂对子宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响[J].中国妇产科临床杂志,2013,14(6):524-527.

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Effect of matrine combined with cisplatin on the expression of tumor suppressor in lung cancer 1 gene in human cervical cancer SiHa cell

LIANG Huan, GUO Guan-rong

(EnshiTujiaandMiaoNationalitiesAutonomousPrefectureHospital,HubeiEnshi445000,China)

Objective To investigate the effect of matrine combined with cisplatin on inhibiting human cervical cancer SiHa cells and on tumor suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) gene expression. Methods Logarithmic growth phase of SiHa cells were divided into control group, matrine group, cisplatin group and combination group. Inhibition rate was measured with MTT method. The change of TSLC1 gene mRNA expression was detected by RT-PCR process in each group. Results Inhibition rates of SiHa cells in the control group, matrine group, cisplatin group and the combination group were 0, 61.24%, 70.31% and 74.20%, respectively. The inhibition rates of medicine intervention groups were higher than the control group (tvalue was 14.21, 17.44 and 11.20, respectively, allP<0.05), and the combination group was higher than cisplatin and matrine group (tvalue was 4.47 and 3.21, respectively, bothP<0.05). There was no significant difference between cisplatin group and matrine group (t=0.71,P>0.05). The levels of TSLC1 mRNA expression after the intervention on SiHa cells in the control group, matrine group, cisplatin group and the combination group were 1.00±0.00μg/mL, 23.53±0.01μg/mL, 84.33±0.03μg/mL and 90.23±0.01μg/mL, respectively. Those of the medicine intervention groups were significantly higher than the control group (zwas 9.41, 10.72 and 13.23, respectively, allP<0.05). There was no significant difference between matrine group and the combination group in TSLC1 mRNA expression level (z=1.24,P>0.05), but both of them were higher than cisplatin group (zvalue was 6.04 and 5.47, respectively, bothP<0.05). Factorial design analysis of variance showed that cisplatin and matrine were influencing factors of inhibiting SiHa cells and TSLC1 gene expression. There was an interaction effect between them so that it generated increasing effect by combination.Conclusion Matrine combined with cisplatin can inhibit the proliferation of human cervical cancer SiHa cells and improve TSLC1 mRNA expression level.

cervical cancer; SiHa cells; cisplatin; matrine; tumor suppressor in lung cancer-1(TSLC1)

2014-07-08

梁 欢(1983-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事中医妇科临床工作。

郭冠荣，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.026

R711.7

A

1673-5293(2014)02-0246-02