早产儿喂养不耐受肠道菌群多样性研究

张良娟，虎崇康，林 燕，江 逊，田 娟，田 姣，雷 达，王宝西

(第四军医大学附属唐都医院儿科，陕西 西安710038)

早产儿喂养不耐受肠道菌群多样性研究

张良娟，虎崇康，林 燕，江 逊，田 娟，田 姣，雷 达，王宝西

(第四军医大学附属唐都医院儿科，陕西 西安710038)

目的 采用变性梯度凝胶电泳聚合酶链反应(PCR-DGGE)技术从微生物生态学的角度分析比较喂养不耐受(FI)与健康早产儿肠道细菌群落结构的多样性及相似性。方法 以2013年11月至2014年9月在第四军医大学附属唐都医院儿科新生儿病房诊断为FI的早产儿为FI组。选择与FI组胎龄、日龄、出生体重相匹配的非FI早产儿作为对照组。采集出现FI时和同时间段对照组的粪便标本，进行16SrDNAV3区扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)，从而分析比较两组间肠道菌群多样性指数及相似性。结果 细菌多样性检测显示FI组的肠道菌群多样性指数香农-维纳指数(H)、丰度(S)、均衡度指数(E)和辛普森多样性指数(D)均低于对照组(均P<0.05)；相似性矩阵图及聚类分析结果显示组内菌群相似性较组间高(P<0.05)；PCA结果同聚类分析一致。结论 肠道微生物群落多样性的改变及群落结构紊乱可能是引起早产儿FI的重要因素。

早产儿；喂养不耐受；变性梯度凝胶电泳；细菌群落多样性；益生菌

新生儿出生时因消化系统发育尚未完全成熟，胃肠功能调节差、胃肠分泌能力低下，在喂养过程中容易出现腹胀、呕吐、胃潴留等症状，当这些症状呈进行性加重并出现喂养障碍时，即发生新生儿喂养不耐受(feeding intolerance，FI)，严重时可致坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)，是引起新生儿高死亡率的主要原因，特别在超低出生体重儿(extremely low birth weight, ELBW)及极低出生体重儿(very low birth weight, VLBW)中多见。研究表明，早期肠道微生物的组成可通过复杂的神经内分泌轴影响肠道营养、屏障功能、感觉-运动功能、激素分泌、血管再生和免疫防御等[1]。因此，生后肠道微生物定植在最终肠道功能发展中起着重要作用。早产儿肠道异常菌群定植可能在FI和NEC发病中起着重要作用[2]。本研究采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术从微生物生态学的角度分析比较FI和健康早产儿肠道微生物群落多样性及结构的差异，为临床医生认识肠道微生物多样性在早产儿FI发病中的作用以及探索新的治疗思路提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2013年11月至2014年9月在第四军医大学附属唐都医院儿科新生儿病房收治的7例FI早产儿为研究对象。入选标准：①孕周在32～37w，出生体重<2 500g，经剖宫产娩出，以配方奶喂养，生时无窒息及脐绕颈史，无羊水污染史，在生后24h内收住新生儿科；②FI诊断标准：无法消化肠内食物，鼻饲下胃内残余量超过喂入量的50%，腹胀、呕吐或两者兼有，扰乱家属的喂养计划[3]；③排除标准：有消化系统先天畸形者、NEC、脓毒症及抗生素、益生菌使用者。对照组选取同时间段与FI组的胎龄、日龄、体重等相匹配未发生FI的7例早产儿。采集出现FI时和同时间段对照组的粪便标本，用消毒EP管收集，冰袋送实验室，-70°保存备用。

1.2 试剂及仪器

使用QIAamp®Fast DNA Stool Mini(QIAGEN，德国)试剂盒提取粪便总细菌DNA基因组，PCR扩增引物采用16SrDNA V3区带GC夹子的357F和518R，引物序列[4]见表1。使用Bio-Rad公司一般PCR仪扩增细菌基因组16SrDNA V3区。采用Touchdown PCR策略，反应体系为50μL：25μL 2×Taq PCR Master Mix；2μL 357f (10μmol/L)；2μL 518r(10μmol/L)；4μL DNA；补足ddH2O至50μL。反应程序：预变性94.0℃ 5min，1个循环；变性94.0℃30s，退火61.0℃30s(每循环降0.5℃)，延伸72.0℃1min，10个循环；变性94.0℃30s，退火56.0℃30s(每循环降0.5℃)，延伸72.0℃1min，25个循环；终延伸72.0℃10min，1个循环。扩增结束后将扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压70V，40min左右，电泳图见图1。

变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)应用Bio-Rad公司的Dcode系统(通用基因突变检测系统)。取10μL PCR的产物进行DGGE分析，采用变性梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100%尿素7mol/L和40%(v)的去离子甲酰胺)在1×TAE缓冲液中150V 60℃下电泳4h，银染法染色30min，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统拍照，DGGE分析见图2。

表1 用于PCR的引物

1.3 数据分析

采用Quantity one 软件对DGGE图谱的电泳条带数、条带密度进行数字化并导出结果计算香农-维纳指数(Shannon-Wiener Index，H)、丰度(Richness，S)、均衡度指数(Evenness，E)和辛普森多样性指数(Simpson’s diversity Index，D)等细菌群落结构多样性指数比较FI及对照组肠道细菌的多样性；采用聚类分析及主成分分析(Principal components analysis，PCA)观察比较其肠道细菌的相似性情况。具体计算公式如下：

E=H/Hmax=H/lnS；

D=1-∑(Ni/N)z(Ni/N)2;

S为DGGE图谱上的每个样本的条带数。

(其中，Pi=样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率，N=DGGE 图谱单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度，Hmax=最大的物种多样性指数。)

2 结果

2.1 一般情况

FI组平均胎龄33.93±1.27w，平均体重2.02±0.35kg，男/女性为3/4；对照组平均胎龄34.47±0.82w，平均体重2.13±0.30kg，男/女为5/2。两组性别、体重、胎龄比较均无统计学差异(均P>0.05)。

2.2 粪便基因组16SrDNA V3区PCR扩增

图1 粪便基因组DNA的PCR产物电泳图

Fig.1 Electropherogram of PCR products of genomic DNA in feces

图中显示，检测到长约200bp左右的目的片段，无拖尾、条带整齐、亮度可、特异性高，适用于下一步的DGGE分析。

2.3 变性梯度凝胶电泳结果

2.3.1 电泳图

FI组及对照组的DGGE图谱结果见图2。图中，一条泳道代表一个样本，泳道的条带越多说明生物多样性越丰富，条带信号的亮度可粗略的代表细菌表达量的强弱。

a-g为FI组，A-G为对照组。从图中可以看出两组的DGGE电泳条带的数目、信号强度均显示不同，且个体间条带数多种多样。

图2 FI组和对照组肠道细菌群落结构的DGGE电泳图谱

Fig. 2 DGGE electropherogram of intestinal bacterial community structure of FI group and the control group

2.3.2 泳道/条带识别图

通过Quantity one 软件对DGGE图谱的14条泳道进行分析，到了以e泳道为标准的DGGE条带强度，见图3。

注：数字1～7代表a～g，8～14分别代表A～G。

图3 FI组和对照组肠道细菌群落结构的条带识别图

Fig. 3 Band identification graph of intestinal bacterial community structure of FI group and the control group

从图中可看到每个样本肠道菌群结构的整体分布情况，其中，条带粗细不一，对应其在DGGE胶上的密度大小不同。图下方为以e作为标准后从高至低排列的样品间相似性百分比。

2.3.3 相似性矩阵图分析

通过Quantity One软件导出戴斯系数，计算出各样品相似性的矩阵，见表2。

整体看各样品间的相似性高低不等，高达87%，低致35.5%。组内比较，FI组其相似性最高达87%，如样品5和7；样品1和2、3和4、4和5、6和7 相似性分别为67%、76.7%、81.1%、70.8%。对照组组内相似性最高如样品11和12为83.5%，余样品8和9、10和11、11和12、13和14分别为80.3%、69.4%、83.5%、69.3%。其中6和11样品相似率为85.6%，可能与患儿胎龄、样本收集时间较为相似等有关。因此，本结果提示组内肠道菌群较组间相似性明显，说明肠道微生物群落在疾病的发病过程中存在着动态变化，且在一种疾病中趋于一致。

表2 FI和对照组肠道细菌群落相似性矩阵

2.4 细菌群落多样性分析

图4 FI组和对照组肠道细菌群落多样性指数比较

Fig.4 Comparison of diversity indexes of intestinal bacterial community between FI group and the control group

从图中可看出，多样性指数的4个指标在FI组均较对照组低(P<0.05)。其中，H值愈小，代表了群落中生物种类愈少，所含信息愈少。E表示群落间的均衡度，可见FI组间生物群落均匀度低于对照组。而丰度S愈大，其结构越复杂，抵抗力稳定性就越大，可见FI组不如对照组稳定。最后，D反映的是群落中的种数，各种个体分配越均匀，指数越高，提示群落多样性好，结果显示D指数FI组较对照组低(均P<0.05)。

2.5 聚类分析

根据DGGE图谱分析软件Quantity One用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)实现不同样品间的聚类分析，如图6。

图5 FI组和对照组肠道细菌群落相似性聚类分析

Fig.5 Similarity clustering analysis of intestinal bacterial community of FI group and the control group

从图中可看出FI组及对照组分别被聚类到不同的簇中。聚类分析中以0.67为截取点，将14个样本聚为5个簇，如样本1和2为一簇；样本8和9为一簇；样本10为一簇；样本13和14为一簇；样本3、4、5、7和6、11、12为最后一簇。其中样本1和2，8和9，13和14相似性相近，表明组内相似性较高；样本10为单一簇，通过观察图4可以发现其与组内样本11相似性为69.4%，较FI组中的任一样本相似性均高；针对最后一簇聚类结果，若以0.74为截取点，可将内部分为2个簇，可明显的发现FI组样本3、4、5和7聚为一簇，样本6、11和12被聚为一簇，其中6号样本可能系由于个体差异未与FI聚类到一起，但从中也可发现样本间组内相似性仍较高，且与组间相似性存在一定的差异。

2.6 主成分分析

采用Canoco软件对DGGE图谱中每个泳道相对应条带的峰值进行PCA。

图6 FI组和对照组肠道细菌群落PCA分析

Fig. 6 PCA analysis of intestinal bacterial community of FI group and the control group

从图中结果可以看出PCA1和PCA2累计方差贡献率为51.7%。将14个样本分为6个类群：类群A为样本3、4、5和7；类群B为样本11、12、13和14；类群C为样本1和2；类群D为样本8和9；类群E、F分别对应样本6和10。均显示组内肠道菌群结构较组间相似明显，与聚类分析结果基本一致。

3 讨论

在肠道复杂的微生态系统中，微生物群落通过细菌与细菌、细菌与宿主间形成相互依赖、相互制约的生态系统，并发挥营养、肠道屏障、防御作用及免疫调节等诸多功能[1,5]，成为宿主代谢过程中不可或缺的一部分。新生儿的健康有赖于肠道菌群定植及菌群间动态平衡来维持。阴道分娩、母乳喂养足月儿的肠道微生物通常被认为是健康有益的。早产儿因受分娩方式、新生儿重症监护病房(NICU)住院时间、禁食及抗生素使用等影响，其肠道菌群的建立过程一直处于变化中，再加之器官发育的不成熟，因此更容易受不平衡菌群的影响发生诸如FI及NEC等疾病。所以，探索FI患儿肠道菌群变化在FI发病中的作用具有重要的临床意义。

3.1 肠道菌群多样性分析

本研究结果显示，FI患儿肠道微生物多样性低于健康儿童。临床观察发现FI是NEC发病的前驱阶段，在NEC病因中占据较大比例。相关研究者通过PCR-DGGE技术研究发现NEC患儿肠道微生物多样性明显低于健康儿童，肠道菌群紊乱是NEC发病的重要机制[6-7]。Arboleya等[8]同样应用该技术分别对早产儿和足月儿出生3个m内第2d、10d、30d及90d的4个时间点的粪便微生物多样性进行检测，结果显示4个时间点早产儿肠道微生物多样性均明显低于足月儿。因此，早产儿肠道菌群种类的减少是引起FI的重要诱因。

3.2 肠道菌群结构分析

本研究结果亦显示，组内肠道微生物群落结构相似性较组间高，即FI患儿肠道菌群结构与健康儿童有明显差异。Smith等[9]人应用PCR-DGGE技术发现与健康儿童相比，NEC患儿的DGGE图谱较为接近，说明一种疾病的不同个体肠道菌群结构是趋于一致的。Schwiertz 等于2003年应用PCR-DGGE技术对NICU的早产儿和足月儿出生4w内粪便微生物多样性进行检测，结果显示足月儿生后5d，条带即达到稳定；而早产儿需10d才可达到稳态。因此，早产儿肠道细菌定植延迟，且足月儿与早产儿肠道细菌结构模式不同。

有研究显示，肠道微生物多样性降低及群落结构紊乱是引起NEC的重要因素[6-7]，而早产儿FI作为NEC发病的前驱阶段，本研究结果同样提示肠道微生物多样性降低及群落结构紊乱是引起FI的重要诱因。FI早产儿因消化系统发育不成熟，胃肠动力、免疫防御等功能不完善，加之肠内细菌过度繁殖、发酵，导致肠壁缺血，容易发展为NEC。诸多研究者对早产儿肠道微生物群落的研究结果提示：新生儿出生后，受个体、环境及喂养等影响，肠道微生物处于动态变化过程中，每个新生儿都有其独特的肠道微生物菌群图谱。正常情况下，宿主为肠道共生菌提供一个稳定的栖息地，共生菌通过提高肠道屏障功能及胃肠道动力，发挥免疫防御作用抵抗危险因素，从而支持肠道结构和功能的完整性。较足月儿相比，早产儿肠道微生物多样性的降低和肠道群落结构的紊乱，扰乱肠道正常功能，严重影响个体发育，容易导致如FI和NEC等疾病的发生发展。并有相关研究显示肠道菌群多样性与早产儿肠道对食物消化耐受能力及体重增长呈正相关[10]。由此可见，通过增加肠道益生菌群的多样性可促进宿主的健康。

近年来关于益生菌的应用越来越广泛，其作用机制通过保护粘膜屏障的完整性、抑制细菌移位、调节细菌定植、发挥免疫防御作用及调控肠道炎症反应等发挥有益的作用[11]。有研究发现益生菌可防止早产儿FI的发生，促进其体重增长，且应用是安全的[12]。研究发现益生菌可有效减少NEC 的发病率，减少NEC发病的严重程度和缩短病程，并减少病死率。应用益生菌治疗此类疾病可能是一种比较有前途的方法，因此，有必要制定益生菌摄入的标准化方案(比如单一或组合菌种、剂量、疗程等)进行多中心实验评估益生菌的利弊。这样，通过早期对FI患儿实施必要的干预措施，尽量避免FI、NEC的发生，从而降低新生儿发病率和死亡率。本研究发现FI患儿肠道菌群多样性较健康新生儿明显减少，因此，应进一步深入观察FI患儿肠道特定优势菌群的改变是否也参与了FI的发病过程，为临床应用益生菌预防和治疗FI提供可靠依据。

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[专业责任编辑：刘黎明]

Investigation of the intestinal microbial community diversity in preterm infants with feeding intolerance

ZHANG Liang-juan, HU Chong-kang, LIN Yan, JIANG Xun, TIAN Juan, TIAN Jiao, LEI Da, WANG Bao-xi

(DepartmentofPediatrics,TangduHospital,TheFourthMilitaryUniversity,ShaanxiXi’an710038,China)

Objective To observe and compare the diversity and similarity of intestinal bacterial community structure of preterm infants who had feeding intolerance (FI) and those who were healthy from the perspective of microbial ecology using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology. Methods The preterm infants diagnosed as FI during December 2013 to September 2014 in neonatal wards of pediatric department of Tangdu Hospital of the Fourth Military University were recruited in FI group. The infants without FI but matched in gestational age, days of age and birth weight during the same period were taken in control group. The stool samples were collected in FI group when FI occurred and in the control group at the same period for conducting 16SrDNA V3 region amplification and DGGE, and thus the diversity and similarity of intestinal bacterial community structure between two groups were analyzed and compared. Results The results of bacterial diversity showed that H, S, E and D of FI group were lower than those of the control group (allP<0.05). Similarity matrix and cluster analysis showed that the intra-group similarity of the flora was higher than inter-group similarity (P<0.05). Principal components analysis (PCA) was consistent with the cluster analysis. Conclusion The change of intestinal microbial community diversity and community structure disorder may be the important factor causing FI in preterm infants.

preterm infants; feeding intolerance (FI); denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial community diversity; probiotics

2014-11-03

国家自然科学基金资助项目(No.81370490)

张良娟(1988-)，女，在读硕士研究生，主要从事儿童消化动力的研究。

王宝西，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.002

R722

A

1673-5293(2015)02-0171-04