蛇床子素对神经干细胞体外分化的影响*

李少恒，胡昱，姚璎珈，教亚男，孔亮，杨青平，陶震宇，杨静娴

(辽宁中医药大学研究生院，大连 116600)

蛇床子素对神经干细胞体外分化的影响*

李少恒，胡昱，姚璎珈，教亚男，孔亮，杨青平，陶震宇，杨静娴

(辽宁中医药大学研究生院，大连 116600)

目的 探讨蛇床子素(Ost)对神经干细胞(NSCs)分化的影响及机制。方法 体外分离并培养新生小鼠脑源NSCs，免疫细胞化学法鉴定；取第5代NSCs置于含不同浓度(0，10，50，100 μmol·L-1)Ost的分化培养液中，免疫荧光细胞化学法检测NSCs分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞情况；RT-PCR检测Notch 1基因及其靶基因Mash 1和Neurogenin 2(Ngn2)表达情况。结果 免疫荧光细胞化学法显示神经球显Nestin/Sox2阳性，即所培养的细胞为NSCs；Ost可促进NSCs更多地向神经元(P<0.01)和少突胶质细胞(P<0.05)分化，而非星形胶质细胞。Ost可减少Notch 1(P<0.01)并增加Ngn 2(P<0.01)mRNA表达，其中以Ost 100 μmol·L-1组最明显。结论 Ost可促使NSCs更多地向神经元和少突胶质细胞分化，其机制可能与Ost抑制Notch信号通路有关。

蛇床子素；神经干细胞；分化；Notch信号通路

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[1]。随着技术的发展，NSCs移植治疗中枢退行性疾病受到研究者关注，其中最基础的是NSCs在体外的增殖和分化。蛇床子素(osthole，Ost)是从伞形科植物独活和蛇床子等中提取分离出来的香豆素类化合物[2-3]。研究证明，Ost具有抗肿瘤[4]、抗肝炎[5]和抗炎[6]等多种药理活性。明磊国等[7]发现Ost对骨髓基质干细胞成骨性分化有一定影响，但对NSCs的分化是否有影响笔者较少见到报道。笔者在本实验中给予NSCs不同浓度Ost，观察NSCs分化情况，观察Ost对NSCs分化的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级昆明种小鼠，购于大连医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)：2008-0002。孕鼠饲养环境为每笼1只，室温(23±2) ℃，给予自来水以及鼠粮(辽宁长生生物技术有限公司)，光照与黑暗时间比例为7：5，待生产后取新生48 h内小鼠用于实验。

1.2 试药 Ost(7-methoxy-8-isopentenoxycoumarin，C15H16O3)购于中国食品药品检定研究院(批号：110822-200705)，溶于二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司，批号：302A035)，终浓度<0.01%，用DMEM/F12(Dulbecco's modified eagle medium：nutrient mixture F-12 ，Gibco公司，批号：8114303)培养液配成各浓度待用。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco公司)，青-链霉素(penicillin-streptomycin，P/S，Thermo公司，批号：J140031)，一抗分别为巢蛋白(Nestin，Millipore公司)、Sox2(Invitrogen公司)、神经元核抗原(neuronal nuclei ，NeuN)一抗(Millipore公司)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，北京博奥森生物公司)、NG2(Upstate公司)；二抗分别为Cy3标记羊抗小鼠IgG(Jackson公司)、Cy3标记驴抗兔IgG(Jackson公司)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记驴抗兔IgG(Jackson公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液(Sigma公司)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Thermo公司)，PCR Master Mix Kit试剂盒(Thermo公司)。

1.3 仪器 倒置荧光生物显微镜(NIB-100F，宁波永新光学股份有限公司)，超低温冰箱(DIV-86L386，青岛海尔股份有限公司)，二氧化碳(CO2)培养箱(BPN，NUAIRE)， PCR仪(MG96G，杭州朗基科学仪器有限公司)，凝胶成像系统(Gene Genius，UVP，上海天能科技有限公司)。

1.4 NSCs的分离、培养与鉴定 取新生(48 h内)小鼠大脑并分离海马和侧脑室下区，剪碎并用0.05%胰蛋白酶于37 ℃消化15 min，终止消化后经筛网过滤，得到细胞悬液。细胞悬液以5×106个·mL-1接种于经多聚赖氨酸包被过的24孔板中，加入含有20 ng·mL-1表皮生长因大(epidermal growth factor,EGF)、20 ng·mL-1碱性成纤维细胞生长固(basic fibroblast growth factor,bFGF)、2%B27和1%P/S的DMEM/F12培养液，置于37 ℃，5% CO2-95% 空气培养箱中培养。每隔3 d换液一次，7 d后取出细胞球，机械吹打为单细胞进行传代培养，取对数生长期细胞用于以下实验。取第5代神经球打散为单细胞，用抗小鼠Nestin抗体和Sox2抗体进行免疫荧光细胞化学染色，显微镜下进行检测鉴定[8-9]。

1.5 免疫荧光细胞化学法检测NSCs分化能力 将第5代NSCs以5×106个·mL-1的密度置于96孔板含有不同浓度(0，10，50，100 μmol·L-1)Ost的DMEM/F12完全分化培养液(含有10% FBS和1% P/S 的DMEM/F12培养液)中培养，每孔100 μL，并相应分为对照组(control组)、Ost 10 μmol·L-1组、Ost 50 μmol·L-1组、Ost 100 μmol·L-1组[10]。7 d后，用免疫荧光细胞化学染色法鉴定分化细胞中神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性蛋白表达[11]，重复3次。

1.6 RT-PCR检测Notch及其靶基因表达 将对照组、Ost 10 μmol·L-1组、Ost 50 μmol·L-1组、Ost 100 μmol·L-1组NSCs以5×106个·mL-1密度置于6孔板含有DMEM/F12完全分化培养液中，每孔4 mL。Trizol 法提取上述4组RNA，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；按照PCR Master Mix Kit 所示比例构建PCR反应。Notch通路相关基因序列见表1。反应条件：预变性95 ℃ 2 min；变形95 ℃ 30 s，退火(Tm-5)℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，扩增40个循环；终延伸72 ℃ 5 min。以β-actin 作为内参。结果用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统分析，Image J图像分析软件对条带进行吸光度扫描，结果用相对吸光度表示，相对吸光度=吸光度目的基因/吸光度β-actin，重复3次。

表1 Notch通路相关基因序列

2 结果

2.1 NSCs的培养与鉴定 第5代NSCs在增殖培养基中逐渐变大成球，经免疫荧光细胞化学法染色神经球呈Nestin/Sox2阳性，核蓝色(图1A、B、C)。经过多次传代，原代神经球形成新的神经球，第2～18代神经球无显著差异(图1D、E)。

2.2 Ost对NSCs分化的影响 见图2A。经免疫荧光染色检测，NSCs形成3种不同类型神经细胞：神经元(NeuN阳性)、少突胶质细胞(NG2阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)，均为红色，核为蓝色。定量分析显示，Ost100 μmol·L-1组NeuN阳性细胞率31.9%，模型对照组17.4%(t=4.699，P<0.01)；Ost100 μmol·L-1组NG2阳性细胞率17.2%，模型对照组9.3%(t=2.841，P<0.05)(图2B)。提示Ost可促进NSCs向神经元和少突胶质细胞分化。

2.3 Ost调节NSCs内Notch通路相关基因的表达 见图3。RT-PCR结果显示，Ost 100 μmol·L-1组相对吸光度0.382，模型对照组0.822(t=4.625，P<0.01)；Ost 100 μmol·L-1组Ngn2相对吸光度0.934，模型对照组0.268(t=8.291，P<0.01)。说明Ost显著减少Notch1 mRNA表达并且增强Ngn 2 mRNA表达，但是其对Mash mRNA的表达无显著改变。

A.光镜下典型神经球；B.Nestin/Sox2 (绿色/红色) 免疫荧光双染神经球；C.DAPI (蓝色) 染色细胞核；D、E.光镜下图像显示从第2到第18代培养的神经球

图1 免疫荧光鉴定(×40)以及传代扩增的神经球(×20)

A.typical neurosphere under the microscope；B.Neurosphere was immunostained with antibodies against nestin (green) and Sox2 (red)；C. Nuclei was stained by DAPI (blue)；D,E.Neurospheres at 2nd passage and 5th passage under the microscope

Fig.1 Neurospheres (×40) identified by immunofluorescence and amplifiable neurospheres after passaged(×20)

神经干细胞分化为NeuN阳性神经元(A)、GFAP阳性星形胶质细胞(B)和NG2阳性少突胶质细胞(C)，DAPI染核；D.不同浓度Ost对NSCs 分化为3种细胞的百分比；与模型对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

图2 Ost对NSCs分化程度百分比比较

NSCs differentiated into NeuN+ neurons(A), GFAP+ astrocytes, NG2+ oligodendrocyte precursors(C), Nuclei were stained with DAPI；D.Percentages of three cells by different concentrations of Ost; Compared with the model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.2 Differentiation percentage of NSCs by Ost

3 讨论

自从REYONDS等[12]从成年小鼠的纹状体中获得能不断增殖的NSCs后，NSCs就受到关注[13]。由于NSCs具有自我更新及多向分化潜能，使其有可能成为治疗中枢退行性疾病的一种有效手段[14]。然而，对NSCs的增殖和分化进行有效调控是需要面对的首要问题。

A.RT-PCR检测NSCs中Notch 1，Mash 1和Ngn 2 mRNA的表达(β-actin作为内参)；B.Image J 检测并比较Notch 1,Math 1和Ngn 2 mRNA 的表达；与模型对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

图3 4组细胞中Notch 1及其靶基因mRNA表达的比较

A.mRNA expressions of Notch 1 and its target genes Math 1 and Ngn 2 were assessed by RT-PCR, normalized with β-actin internal control；B.The mRNA expressions were assessed and compared by Image J；Compared with the model control group，*1P<0.01，*2P<0.05

Fig.3 Compared with the mRNA expression of Notch 1 and its target genes among four groups of cells

Notch基因由MORGAN等在果蝇中发现，因其部分丧失功能性突变在果蝇翅的边缘造成缺口而得名。研究表明，动物中相邻细胞可通过Notch受体传递信号，调节增殖、分化及凋亡等过程，影响器官的形成及形态的发生[15]。有证据表明细胞表面的Notch 1可被相邻细胞表面的配体激活，经蛋白水解后的活化形式(NICD)释放入核内，并与其上的CSL DNA结合蛋白结合形成复合物，激活Hes等靶基因产生转录因子。后者通过抑制碱性螺旋-环-螺旋转录因子(basic helix-loop-helix-domain，bHLH)家族与神经产生的相关基因如Mash 1、Neurogenin 2等的转录，体现“旁侧抑制”，进而抑制细胞分化，维持NSCs的原始状态[16-18]。

本实验按照YANG等[11]介绍的方法成功培养NSCs，经鉴定该细胞为实验所需要的NSCs。在此基础上，笔者加入不同浓度Ost来观察其分化情况，发现Ost能使NSCs更多地向神经元和少突胶质细胞分化并与浓度呈正相关。为此笔者还研究了在NSCs分化过程中Ost对Notch 1及其靶基因Mash 1和Ngn 2的作用。结果发现Ost能使Notch 1表达下降，Ngn 2表达上升，提示Ost可能通过抑制Notch信号通路来促使NSCs向神经元和少突胶质细胞分化，其作用机制有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.003

Effects of Osthole on Differentiation of Neural Stem Cellsinvitro

LI Shaoheng，HU Yu，YAO Yingjia，JIAO Yanan，KONG Liang，YANG Qingping，TAO Zhenyu，YANG Jingxian

(GraduateSchool,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective To investigate the effects of osthole on neural stem cells (NSCs) differentiation and explore the potential mechanism. Methods Brain-derived NSCs from newborn mice were isolated and culturedinvitroand determined by immunofluorescence.The P5 generations of NSCs were placed in culture solution with osthole at concentrations of (0,10,50,100 μmol·L-1).The neuron, astrocyte and oligodendroglia cell differentiation were determined by immunofluorescence.The mRNA expression of Notch 1 and its target genes Mash 1 and Neurogenin 2 were assessed by RT-PCR. Results The neurosphere displayed Nestin and Sox 2-postive by immunofluorescence, suggesting that the cultured cells were NSCs.Osthole promoted NSCs differentiating into more neuron(P<0.01) and oligodendrocyte(P<0.05), but not astrocyte.Meanwhile, osthole significantly reduced the mRNA expression of Notch 1(P<0.01) and increased Ngn 2(P<0.01)at the dose of 100 μmol·L-1. Conclusion Osthole enhances NSCs differentiating into more neuron and oligodendrocyte via probablly inhibiting Notch signal pathway.

Osthole；Neural stem cells；Differentiation；Notch signal pathway

2014-07-05

2014-08-12

*国家自然科学基金资助项目(81173580)；国家自然科学基金国际合作交流项目(81210108050)；沈阳市科技专项资金项目(F11-264-1-42)

李少恒(1992-)，男，黑龙江鹤岗人，在读硕士，专业方向：中药药理学。E-mail：lsh199242@163.com。

杨静娴(1963-)，女，辽宁大连人，教授，博士，从事神经药理学研究。电话：0411-87586009，E-mail：jingxianyang@yahoo.com。

R285.5；R965

A

1004-0781(2015)07-0856-05