节律基因蛋白CRY1在食管癌及癌旁组织中的差异性表达及意义

李婷婷李光明△孙凤飞王平张旭乾

(1.川北医学院第二临床学院南充市中心医院肿瘤防治中心,四川南充 637000; 2.川北医学院第二临床学院南充市中心医院病理科,四川南充 637000)

论 著

节律基因蛋白CRY1在食管癌及癌旁组织中的差异性表达及意义

李婷婷1李光明1△孙凤飞1王平2张旭乾2

(1.川北医学院第二临床学院南充市中心医院肿瘤防治中心,四川南充 637000; 2.川北医学院第二临床学院南充市中心医院病理科,四川南充 637000)

目的:探讨节律基因Cry 1表达的CRY 1蛋白在食管癌中的表达及其与临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测40例食管癌组织,40例癌旁组织中CRY1的表达。结果:40例食管癌组织中CRY1的弱阳/阳性表达(免疫组化染色强度评分大于等于2分)率为17.5%,而40例食管癌旁组织标本CRY1的阳性表达率为75%,两组表达的差异性具有统计学意义(P＜0.01)。且表达强度与患者年龄、性别,肿瘤组织性质、侵及深度、淋巴结转移情况无明显相关性。结论:Cry 1基因在正常组织中高表达,而在食管癌组织中低表达,可能作为一种抑癌基因影响肿瘤的发生发展。

节律基因;Cry 1;食管癌;免疫组化

生物节律是所有生物都具有的一种内源性周期性节律,由视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)产生。目前发现的节律基因有:Period 1,2,3;Clock;Cry 1,2;Timeless;Cycle; Doubletime;Cryptochroe;Bmal 1等。已有部分研究报道在不同组织来源中表达存在差异性,并且有望成为预测某些疾病的分子标记物。我们的前期研究发现在食管癌中,PER2蛋白是低表达的[1],在癌旁组织中高表达,那么同样作为节律基因Cry 1表达的CRY 1蛋白,它的表达程度是否存在差异,能否为我们诊断或治疗食管癌提供方向,我们开展了以下实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象

40例食管癌组织均来自2010年-2011年我院收治的食管癌患者行根治性切除术后存档的石蜡包埋标本。40例患者中,男性27例,女性13例,年龄45～78岁,中位年龄56。术前均为行放化疗。癌旁组织取自远离肿块边缘5 cm以上食管组织。切缘均无残留。病理类型均为鳞癌。

1.1.2 主要试剂

免疫组织化学分析采用即用型二步法。一抗为多克隆兔抗人Cry1抗体(编号:CRY1(H-84):sc-33177)购自Santa Cruz公司。二抗为通用型Polymer kit(编号:PV-6000),购自北京中衫生物技术有限公司,二氨基联苯胺(DAB)底物试剂盒(编号: ZLI-9017),购自北京中衫生物技术有限公司。

1.2 方法

石蜡块制成5μm厚连续石蜡切片,脱蜡,梯度乙醇水化。抗原修复采用EDTA抗原修复液,1000 W加热沸腾,修复时间为2.5 min,室温自然冷却。3%H2O2消除内源性过氧化物酶,室温孵育20 min,PBS洗2～3次。一抗(PBS稀释至1:150) 37℃孵箱孵育2 h,PBS洗2～3次。二抗37℃孵箱孵育1 h, PBS洗2～3次。DAB37℃孵箱孵育8～15 min染色,显微镜下观察,适时终止反应,蒸馏水冲洗2～3次。苏木素复染,脱水、透明、封片、镜检。用已知CRY1阳性表达的组织切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。

CRY1染色以细胞核出现黄色或棕褐色颗粒为阳性。参考文献[2]建立免疫组化染色强度评分标准。首先是染色强度评分:无染色为0分:细胞膜或胞质呈现淡黄色颗粒,明显高于背景为1分;细胞膜或胞质呈现浅棕黄色颗粒为2分:出现大量深棕黄色颗粒为3分。然后根据阳性细胞数进行评分:每片随机观察5个视野。计数500个细胞中染色阳性细胞数。阳性细胞数＜5%为0分;阳性细胞数5%～25%为1分;＞25%～75%为2分;＞75%为3分。染色强度评分与阳性细胞数比例的评分相加之和为总分(0-6分)。

1.3 统计学处理

数据分析采用SPSS13.0软件包处理,显著性差异比较采用秩和检验。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

免疫组化结果显示在正常癌旁组织中CRY1阳性表达率为75%(30/40),均着色于细胞浆和细胞核(图1A)。食管癌组织中表达低(7/40,17.5%),且着色部位不规则(图1B)。具体评分结果见图2。经过统计分析,食管癌组织与正常癌旁组织中的CRY1差异性表达具有统计学意义,P＜0.01。

图1 食管癌旁组织及食管癌组织CRY1免疫组化染色(400×)

此外我们依据评分,就患者的年龄、性别、肿瘤病理类型、肿瘤侵润深度及淋巴结转移情况进行相关性分析后,得出的结果如表2所示,CRY1的表达强度与上诉因素均无明显相关性,(P＜0.05)。

图2 食管癌旁组织及食管癌组织Cry1免疫组化染色评分结果

表2 CRY1表达强度评分与相关指标的相关性分析

3 讨论

食管癌是川北地区的高发恶性肿瘤之一,我们深入研究其相关发病基因,是希望对食管癌的诊断及治疗有较全面的认识。

hCry 1(Cryptochrome 1,GeneBank Accession No.BC030519)基因位于染色体12q23.q24.1,全长3044 bp,含13个外显子和12个内含子。其基因编码586 aa的蛋白质,分子量约为66 kDa。该基因能在身体各组织中表达。在果蝇和拟南芥中大量研究结果揭示,Cryptochrome可以被认为是动植物控制生物节律过程中感受光的主要的感光色素[3-4]。有研究发现Cry 1在体外培养的肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、脑胶质瘤细胞、宫颈癌细胞中均有表达,且存在24小时波动性[5]。但是Cry 1与食管癌或食管癌细胞株相关的报道却很少。

本项研究发现CRY在食管癌组织与癌旁组织中均有表达,但表达强度存在差异性,在正常组织中高表达,在食管癌组织中低表达。这种差异可能就是导致食管癌发生发展的因素之一。Nuri Ozturk[6]在P53基因突变小鼠敲除Cry 1基因后发现Cry 1的缺失可延缓肿瘤的发生,并延长小鼠的生存期。Cry可显著影响细胞的增殖,它的缺失可能成为一个肿瘤发展的保护因子。Tokunaga[7]在08年报道Cry 1相较于正常卵巢组织,在卵巢癌中高表达,在粘液腺癌和3期肿瘤中表达量有明显下降。Cry 1有可能成为一个可预测卵巢上皮癌的分子标记物。Takashi Oshima[8]等在研究结肠癌中发现,CRY1的表达在肿瘤组织与癌旁正常组织中是相似的,无明显差异。但食管癌的组织类型不同于卵巢癌,生物学行为也可能不同。这有待与大量的临床标本实验证实。另外,我们试验中发现在部分近胃或贲门的手术切缘标本中CRY1表达较强。

另一方面,我们也发现CRY1蛋白在食管肿瘤组织与正常组织间的这种差异性表达,与患者年龄、性别、肿瘤组织性质、肿瘤侵及深度及是否存在淋巴结转移这五种因素,并无明确相关性。可推测时辰基因Cry 1可能对食管癌的发生有一定影响作用,但在筛查或预测其肿瘤进展、预后方面无确切意义,需要进一步大样本深入研究。

总之,CRY1在食管癌中的低表达,癌旁组织中高表达,说明生物节律紊乱与食管癌的发生有一定关系。

1 李婷婷,李光明,唐治蓉.PER2在食管癌及癌旁组织中的差异性表达及意义[J].四川生理医学杂志,2011,33(4):153-154.

2 Wang LD,Shi ST,Zhou Q,et al.Changes in p53 and cyclin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human esophageal and gastricardia carcinogenesis[J].Int J Cancer,1994,59(4): 514-519.

3 Kume K,Zylka MJ,Sriram S,et al.m CRYl and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop[J].Cell,1999,98(2):193-205.

4 Vitaterna MH,Selby CP,Todo T,et al.Differential regulation of mammalian Period genes and circadian rhythmicity by cryptochromes 1 and 2[J].Proc Natl AcadSci USA,1999,96(21):12114 -12119.

5 张艳.生物节律相关基因BMALl和CRYl在肝癌发生发展中的功能和机制探讨[D].上海:复旦大学,2005.

6 Ozturk N,Lee JH,Gaddameedhi S,et al.Loss of cryptochrome reduces cancer risk in p53 mutant mice[J].Proc Natl AcadSci USA, 2009,106(8):2841-2846.

7 Tokunaga H,Takebayashi Y,Utsunomiya H,et al.Clinicopathological significance of circadian rhythm-related gene expression levels in patients with epithelial ovarian cancer[J].Acta Obstet Gynecol Scand 2008,87(10):1060-1070.

8 Oshima T,Takenoshita S,Akaike M,et al.Expression of circadian genes correlates with liver metastasis and outcomes in colorrectal cancer[J].Oncol Rep,2011,25(5):1439-1446.

Differential expression and clinical significance of CRY1 in esophageal carcinoma and adjacent tissues

Li Ting-ting1,Li Guang-ming1△,Su Feng-fei1,Wang Ping2,Zhang Xu-qian2
(1.Cancer Center of Nanchong Central Hospital,The Second Clinical School,North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637000;2.Department of Pathology,Nanchong Central Hospital,The Second Clinical School, North Sichuan Medical College,Sichuan Nanchong 637000)

Objective:To investigate the expression of CRY1 in esophageal carcinoma and adjacent tissue to analyze its clinical sig-nificance.Methods:The expressions of CRY1 in 40 cases of esophageal carcinoma and 40 cases of adjacent tissue were measured by imunohistochemistry.Results:Thirty-three specimens in esophagus carcinoma tissue present CRY1 negative expression and 7 cases weakly positive expression(the intensity of expression≥2:17.5%).While 40 specimens in adjacent tissue of esophagus carcinoma appeared CRY1 positive expression(the intensity of expression≥2:75%).There is significant difference between two groups(P＜0. 05).And,there was no significant correlation between the expression intensity and patient s’age,gender,tumor tissue nature, depth of invasion and numbers of lymph node metastasis.Conclusions:Cry1 perhaps influence the progression of esophagus cancer as a tumor suppressor gene.

Clock gene;CRY1;Esophagus carcinoma;Immunohistochemistry

2015-5-27)

李婷婷,女,住院医师,主要从事肿瘤内科临床工作,Email: family861314@sina.com。

△通讯作者:李光明,男,教授,主要从事肿瘤时辰治疗工作,Email: Liguangming99999@yahoo.com.cn。