我国部分地区奶山羊无浆体感染情况的调查

张文静，张志敏，崔艳艳，吕亚莉，张菲菲，王金鸿，曹树轩，菅复春，王荣军，张龙现，宁长申＊

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；2.陕西省微生物研究所，陕西西安710043；3.安阳市一中，河南安阳455000；4.河南正大畜禽有限公司，河南孟津471121）

在世界范围内，奶山羊饲养量呈现持续增长趋势，且拥有良好的市场前景，越来越受到人们的重视和青睐。我国有着悠久的奶山羊养殖历史，是世界上奶山羊饲养最多的国家之一。近年来，我国奶山羊的存栏量也不断上升，据统计，2001、2004、2005、2008、2012年我国奶山羊存栏数分别为478万只、450万只、530万只、550万只、1 200万只［1-2］。羊奶具有营养丰富、易于吸收等优点，是营养专家公认最接近人奶的乳品，并被称为“奶中之王”［3］。随着人们生活水平的提高，羊奶及其产品的独特营养保健功能日益被消费者认可和接受。

无浆体病（Anaplasmosis），旧称边虫病，是由无浆体（Anaplasma）经蜱等节肢动物传播而引起多种动物和人的一种细胞内专性寄生的血液传染病［4-5］。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，也是我国出入境动物检疫对象之一［6-7］。该病分布广泛，绵羊和山羊均易感染。羊感染无浆体后，临床特征以高热、贫血、消瘦、黄疸为主，严重感染时会引起死亡。

为了解我国奶山羊无浆体病的流行情况，并为该病的防控提供科学参考和依据，本研究应用PCR技术对河南、云南、陕西地区的奶山羊无浆体感染情况进行了调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2012年7月至2014年9月从河南省（洛阳宜阳、洛阳涧西区、新密市、南阳市西峡县、开封、平顶山、商丘宁陵县）、云南省（昆明市）、陕西省（富平县、麟游县、泾阳县、高陵县）共12个县区采集的血液样品300份、羊奶样品204份。血液样品置于2mL EDTA-K2抗凝管内；羊奶样品置于已灭菌的10mL EP管内；采集的样品均置4℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要仪器及试剂 血液基因组DNA提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司产品（批号为DK602-01）；DYY-5型稳压稳流电泳仪及JY系列电泳槽，北京市六一仪器厂生产产品；6× DNA loading buffer、DNA Marker DL 2000、rTaqDNA Polymeras、dNTP Mixture、10×PCR buffer、BSA、LATaqDNA Polymeras、dNTP Mixture、10×LA PCR buffer等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用DNA提取试剂盒，按照说明书方法提取DNA。

1.2.2 PCR 扩增 牛无浆体（A.bovis）16S rRNA基因的扩增：第一轮引物 EE1、EE2［8］，PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃ 10min；第二轮引物AB1f、AB1r［9］，PCR扩增条件为94 ℃ 5min；94 ℃1min，55 ℃ 1min，72 ℃ 1min，40个循环；72℃10min。

嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）的16 S rRNA基因扩增引物：一轮引物 EE1、EE2［8］，二轮引物SSAP2f、SSAP2r［10］。扩增条件同A.bovis。

绵羊无浆体（A.ovis）的MSP4基因扩增：参考王贵强等［11］报道的一轮引物AMOf／AMOr和二轮引物MSP4f／MSP4r。第一轮PCR扩增条件为94℃3 min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min；第二轮PCR扩增条件为94℃3min；94℃20s，58℃20s，72℃1min，40个循环；72℃10 min。

以上引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳。每次PCR扩增均设阳性、阴性对照。

表1 无浆体PCR引物Table 1 Primers used for Anaplasma PCR

2 结果

2.1 PCR扩增结果

应用 AB1f／r、SSAP2f／r和 MSP4f／r 3对引物对采集的300份奶山羊血液样品和204份羊奶样品进行PCR扩增，结果共检出A.phagocytophilum、A.bovis和A.ovis3种无浆体，片段长度大小与预期一致（641、551、584bp）（图1～图3）。

2.2 不同地区奶山羊血液中无浆体感染情况

调查结果（表2）显示，奶山羊血液无浆体总阳性率为23%（69／300），其中，宜阳、涧西区和新密市阳性率达100%，麟游阳性率较高为83.33%，而开封、宁陵、昆明、泾阳、富平未见感染。不同种无浆体的阳性率存在差异，分别为A.phagocytophilum18%、A.bovis21.67%、A.ovis5.33%；陕西奶山羊3种无浆体的阳性率分别为A.phagocytophi-lum20.09%（47／234）、A.bovis20.94%（49／234）、A.ovis6.41%（15／234），河南分别为A.phagocytophilum11.11%（7／63）、A.bovis25.4%（16／63）、A.ovis1.59%（1／63）。

2.3 不同品种奶山羊血液无浆体感染情况

不同品种奶山羊无浆体的感染情况不同，杂交奶山羊血液无浆体阳性率（87.10%）明显高于本地奶山羊阳性率（28.57%）和关中奶山羊阳性率（26.09%），而萨能奶山羊未见感染无浆体（表3）。

图1 A.phagocytophilum16SrRNA基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA gene of A.phagocytophilum

图2 A.bovis 16SrRNA基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of 16SrRNA gene of A.bovis

图3 A.ovis MSP4基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of MSP4gene of A.ovis

表2 不同地区奶山羊血液中无浆体的感染率Table 2 The infection rates of Anaplasmas in blood of dairy goats from different regions

2.4 不同饲养模式奶山羊血液无浆体感染情况

放牧奶山羊无浆体阳性率（48.20%）显著高于舍饲羊无浆体阳性率（17.39%）（表4）。

2.5 奶山羊血液中无浆体混合感染情况

300份奶山羊血样中同时检测出2种及其以上无浆体者占31%（93／300）。不同种无浆体混合感染情况见表5。

2.6 奶山羊羊奶中无浆体感染情况

共采集和检测204份奶山羊羊奶样品，仅在洛阳涧西区的1份羊奶样品中检出A.ovis，阳性率为0.49%（1／204）。

表3 不同品种奶山羊血液无浆体感染率Table 3 The infection rate of Anaplasmas in blood of dairy goats from different species of dairy goats

表4 不同饲养模式下奶山羊血液中无浆体的感染率Table 4 The infection rates of Anaplasmas in blood of dairy goats from different feeding patterns

表5 无浆体混合感染情况统计Table 5 The statistics of mixed-infection of Anaplasmas

3 讨论

3.1 无浆体感染在陕西、河南奶山羊中普遍存在

2012年，孙明等［12］对我国甘肃省219份样品的羊无浆体病调查显示，ELISA检测阳性率为34.7%，PCR检测为30.6%。2012年，Liu Z等［13］对我国中南部河南省、湖北省、贵州省和浙江省的262份羊血液样品无浆体感染情况调查，发现阳性率高达73.9%。本试验对300份奶山羊血液样品检测发现，无浆体总阳性率为23%，而在河南省为28.57%，陕西省为21.79%，两省间奶山羊的阳性率有一定差异；此外，各省不同地区奶山羊的无浆体阳性率差异很大，可能与饲养方式有关。在云南昆明的3份奶山羊血样中未见无浆体感染，因样品量小，有待进一步调查。

3.2 不同品种奶山羊无浆体感染率存在差异

目前国内尚未见关于不同品种奶山羊无浆体感染情况的报道。本次调查显示，杂交奶山羊血液中的无浆体阳性率最高，达87.10%，本地奶山羊、关中奶山羊的阳性率分别为28.57%、26.09%，3例萨能奶山羊未见无浆体感染。此结果是否与不同品种奶山羊对无浆体的易感性等存在差异，有待进一步探讨。

3.3 放牧奶山羊血液中无浆体阳性率显著高于舍饲羊

有关羊无浆体病流行病学调查的报道多集中于放牧饲养的羊群［12-14］，而对舍饲羊的相关报道很少。孙明等［12］PCR检测结果显示甘肃省阳性率为30.6%。Liu Z等［13］报道野外无浆体阳性率高达73.9%。范德生等［14］的调查结果显示新疆伊犁地区放牧羊的无浆体阳性率为38.9%。本研究通过对不同饲养模式下奶山羊无浆体的感染情况调查结果显示，放牧奶山羊的无浆体阳性率为48.20%（67／139），显著高于舍饲奶山羊的1.24%（2／161）。无浆体病属蜱源性疾病，放牧奶山羊阳性率高与在放牧条件下被硬蜱叮咬、传播病原直接相关，因此，在养羊生产中应加强对硬蜱的防控。

3.4 奶山羊奶样中无浆体阳性率较低

目前尚未见有关于羊奶中无浆体感染情况的报道。本研究对204份奶山羊羊奶样品进行PCR检测，仅在河南洛阳郊区放牧加舍饲奶山羊的1份奶样品中检出A.ovis，奶样中无浆体总阳性率仅为0.49%（1／204），显著低于血液无浆体阳性率，可能与无浆体均寄生于血细胞内而不易进入羊奶中有关。

本调查显示，无浆体在我国部分地区奶山羊中广泛存在，给奶山羊养殖业带来一定危害，尤其嗜吞噬细胞无浆体属人兽共患病原，临床应予以高度重视。虽然本调查显示羊奶中无浆体的阳性率较低，但在患病条件下，无浆体更易于随血细胞进入羊奶，因此应加强羊病与血液及羊奶中无浆体的研究与监测，为保障人、羊健康服务。

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