H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

刘婷婷，谢芝勋，宋德贵，谢志勤，邓显文，谢丽基，黄 莉，罗思思，黄娇玲，曾婷婷

（1.广西师范大学生命科学学院，广西桂林541004；2.广西壮族自治区兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是单股负链、分节段的RNA病毒，属于正黏病毒科A型流感病毒属，其基因组长约13kb，含有8个基因节段，分别编码 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白［1-3］。其中HA、NA基因是两个比较重要的基因节段，研究表明HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系［4］，因此，在对AIV的研究中多将重点放在对HA和NA基因的研究。

H3N2亚型AIV是低致病性的，在禽类中呈隐性携带，被感染的禽类通常不发病或症状表现较轻，往往不被人们所注意。在对H3亚型AIV进行分离纯化、鉴定中发现，H3N2亚型在H3亚型AIV中为较多组合的血清型亚型。同时，在猪流感病毒与人流感病毒中H3N2亚型也为较常见亚型之一，这就为两种宿主的流感病毒在猪"混合器"中发生基因重排提供了条件。因此，应加强对H3N2亚型AIV的监测，而传统的血清学检测方法对NA亚型的检测存在局限性。实时荧光定量RT-PCR是一种将普通PCR方法与荧光检测方法相结合的技术，通过在PCR反应体系中加入能与扩增模板特异性结合并标有荧光基团的探针，监测每一时刻产物的集聚程度［5］。该法具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、可定量检测等特点。尤其是多重实时荧光定量PCR在临床多种病原混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势［6-7］。目前，针对H3N2亚型AIV多重实时荧光定量RT-PCR方法尚未见报道，因此，本研究建立了一种H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR，旨在为H3N2亚型AIV的监测提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DNA／RNA抽提试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；pMD-18T试剂盒、反转录试剂和荧光PCR Premix ExTaq，宝生物（大连）有限公司产品；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，广州东盛生物科技有限公司产品。

1.1.2 毒 株 H1N1 、H3N2、H3N6 、H3N8、H4N2、H4N6、H6N1、H6N6、H6N8、H9N2 亚 型AIV由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室分离保存，H5N1、H7N2亚型AIV RNA为香港大学惠赠，新城疫病毒（NDV）F48E9、传染性支气管炎病毒（IBV）H52、传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京株、鸡毒支原体（MG）S6及禽呼肠病毒（ARV）S1733由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室保存提供。

1.1.3 其他 SPF鸡胚，北京梅里亚公司产品；Lightcycler2.0荧光定量PCR仪，Roche公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物与TaqMan探针的设计与合成 根据GenBank中H3N2亚型AIV HA、NA基因保守序列，利用Primer Express3.0软件，设计了两对特异性引物和两条TaqMan探针，并通过Blast验证，保证引物扩增出对应的靶基因，且不与其他亚型AIV发生交叉。引物与探针由TaKaRa公司合成，序列见表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 病毒RNA的抽提与反转录 参照DNA／RNA抽提试剂盒说明书提取各亚型AIV及NDV、IBV和ARV的RNA，并用随机引物（9mer）进行反转录，将反转录的cDNA及抽提的ILTV、MG的DNA，置-30℃保存备用。

1.2.3 标准品的制备 以 H3N2亚型 AIV的HA、NA基因全长通用引物进行PCR扩增，阳性产物经胶回收纯化后，连接到pMD18-T载体，提取阳性克隆质粒AIV-H3和AIV-N2送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。参照Sambrook J的方法［8］测定核酸的浓度与纯度，计算各质粒的拷贝数。

1.2.4 双重实时荧光定量PCR反应条件的优化应用AIV-H3和AIV-N2质粒作为标准品，采用20μL PCR 反应体系：real-time PCR premix 10μL，AIV-H3、AIV-N2引物和探针终浓度采用矩阵法在0.2μmol／L～0.8μmol／L之间调整，模板2μL，以ddH2O补足20μL。根据结果筛选出能够检测H3N2亚型AIV，且对Ct值和扩增效率影响不大的引物和探针配比浓度，建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。

1.2.5 敏感性试验与标准曲线的建立 用含有目的片段的AIV-H3、AIV-N2质粒做标准品，对其进行10倍系列稀释后，将相同拷贝数的质粒混合作为模板进行实时荧光定量RT-PCR，并建立标准曲线。

1.2.6 特异性试验 利用优化好的双重实时荧光定量RT-PCR反应体系，对各亚型AIV和上述常见禽病病原体进行扩增，以ddH2O为模板作为阴性对照，对仪器中的每个检测孔同时收集FAM和ROX两种荧光信号，确定该检测方法的特异性。

1.2.7 重复性试验 按照优化好的双重实时荧光定量RT-PCR，以1×108拷贝／μL的 AIV-H3和AIV-N2质粒为标准品，分为5个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）来验证实时荧光定量PCR的批内重复性。在第4天、第7天后重复检测保存于-20℃的模板，验证模板的稳定性及实时荧光定量PCR的批间重复性。

1.2.8 干扰性试验 将AIV-H3和AIV-N2质粒标准品按不同浓度进行组合（1×108和1×102；1×102和1×108；1×108和1×103；1×103和1×108），分别用双重实时荧光定量RT-PCR和单重荧光定量PCR检测，确定模板浓度相差较大时二者的检测是否存在干扰。

1.2.9 临床样品检测 抽提从广西南宁市活禽市场采集的96份咽喉、泄殖腔拭子样品的RNA，应用所建立的H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RTPCR方法进行检测。同时对这96份样品进行抗生素处理后，用鸡胚法分离病毒，用传统血清学方法验证HA亚型的准确性，通过普通RT-PCR扩增NA基因，进行克隆测序验证NA亚型准确性。

2 结果

2.1 双重实时荧光定量RT-PCR反应条件

通过对AIV-H3、AIV-N2引物对及探针终浓度的优化，最终确定最佳反应体系为real-time PCR premix 10μL，AIV-H3、AIV-N2引物和探针终浓度均为0.4μmol／L，模板2μL，以无RNA酶的超纯水补足20μL，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。反应程序为：94℃30s；94℃10s，60℃20s，共40个循环；40℃结束反应。

2.2 敏感性试验结果及标准曲线的建立

将相同拷贝数的AIV-H3质粒和AIV-N2质粒混合作为模版进行双重实时荧光定量RT-PCR扩增，结果如图1，在FAM荧光通道（530nm激发光下）H3亚型AIV检测下限为1×102拷贝／μL，根据Ct值和质粒标准品拷贝数的对数值而建立的标准曲线回归方程为：y＝-3.23x＋41.21（x代表模板拷贝数的对数值，y代表Ct值），在ROX荧光通道（610nm激发光下）（图2）N2亚型AIV检测下限为1×102拷贝／μL，根据Ct值和质粒标准品拷贝数的对数值而建立的标准曲线回归方程为：y＝-3.28x＋41.31，结果表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为1×102拷贝／μL，且Ct值与标准品的浓度具有良好的相关性。

2.3 特异性试验结果

特异性结果显示，H3N2亚型AIV在FAM和ROX荧光通道均产生扩增曲线，H3N6、H3N8亚型AIV在FAM荧光通道（530nm激发光下）出现扩增曲线，在ROX荧光通道（610nm激发光下）为直线，H4N2、H7N2、H9N2亚型AIV在ROX荧光通道出现扩增曲线，在FAM荧光通道为直线，其他亚型AIV和常见禽呼吸道疾病病毒在FAM和ROX荧光通道检测均为直线，与实验设计相符（图3）。

图1 H3亚型AIV的敏感性及标准曲线Fig.1 The sensitivity and the standard curve of real-time RT-PCR for H3

图2 N2亚型AIV的敏感性及标准曲线Fig.2 The sensitivity and the standard curve of real-time RT-PCR for N2

图3 Real-time RT-PCR特异性试验Fig.3 The specificity assay of real-time RT-PCR

2.4 重复性试验结果

在批内重复性试验中，对H3和N2亚型相同浓度质粒标准品混合物作为模板进行5次平行双重实时荧光定量RT-PCR，5个平行反应在相应的荧光通道下均获得扩增曲线（图4），H3亚型AIV通道Ct值变异系数为0.31% ，N2亚型AIV通道Ct值变异系数为0.30% ，对上述模板，以相同反应条件4d和7d后进行批间重复试验，Ct值变异系数分别为1.28%、1.35%。结果表明，本研究建立的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性良好，可以满足临床检测的要求（表2和表3）。

图4 Real-time RT-PCR组内重复性试验Fig.4 The repeatability of real-time RT-PCR in one group

表2 组内重复性试验Table 2 Repeatability test in the group

表3 组间重复性试验Table 3 Repeatability test between groups

2.5 干扰性试验结果

将AIV-H3和AIV-N2质粒标准品模板按不同浓度进行组合时发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度低时，仍可在不同荧光通道下分别检测到2个模板，并与单项荧光PCR检测的Ct值的变异不大。

2.6 临床样品检测结果

应用该法对96份临床样品进行检测，结果显示，检出 H3N2亚型 AIV 4份（阳性率为4.17%），检出单H3亚型AIV 1份（阳性率为1.04%），检出单N2亚型AIV 17份（阳性率为17.70%），检测结果与病毒分离鉴定结果一致。

3 讨论

H3N2亚型AIV的致病力较低，在流行病学中的作用常被忽视。近年来，研究发现H3亚型AIV不仅可引起禽类的感染，也可以感染猪、马、犬等哺乳动物。由于流感病毒聚合酶保真性低，当同一宿主同时感染多种流感病毒时，容易发生基因重排，形成新的病毒毒株，造成对人类健康的威胁。1968年暴发的香港流感病毒A／HongKong／68（H3N2）经研究证实就是由人的H2N2亚型流感病毒与H3亚型AIV的HA基因重排得来，其PB1基因也来自于AIV［9-10］。因此，建立一种快速检测 H3N2亚型AIV的方法显得尤为重要。

实时荧光定量RT-PCR是一种高敏感型、特异性、准确可靠的一种检测技术，目前，应用于多项病毒的检测［11-16］。本研究针对 H3N2亚型 AIV的HA基因和NA基因的保守序列，通过Primer Express 3.0软件，设计并筛选出2套荧光TaqMan探针和引物，通过优化引物与探针的配比浓度，建立了H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR。该方法具有较高的敏感性，可检测到100拷贝／μL的H3N2亚型AIV；可一管检出H3N2亚型AIV感染，也可鉴别单个H3亚型或N2亚型AIV的感染，且相互间没有干扰，实现了一管二检的目的，节省了成本。同时，该方法对其他亚型AIV和常见禽病病原体的检测均为阴性，表明本研究建立的H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有较高的特异性；通过重复性试验表明，Ct值变异系数均小于3%，检测体系稳定，具有良好的重复性。该双重实时荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比，整个反应过程仅需30min左右即可完成，而且不需要EB染色，减少了环境污染，整个扩增过程可以通过电脑实时观察，简便、直观，实现了对H3N2亚型AIV快速检测的目的。因此，本研究所建立的H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有一定的有效实用性，对H3N2亚型AIV的早期诊断和有效防控具有重要意义。

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