鸡传染性支气管炎病毒弱毒株ZZ-V35在鸡胚中的增殖规律

闫艺婷，潘耀谦，王 青，勾肖晶，刘 静1，，黄亚明，杨激辉，刘兴友＊

（1.河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003；2.畜禽智能化清洁生产河南省工程实验室；河南新乡453003；3.动物病毒病防控与药残分析河南省重点学科开放实验室，河南新乡453003）

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。病鸡主要的临床表现为咳嗽、打喷嚏、生长发育迟缓、产蛋量减少和蛋的品质下降等。另外，患鸡的免疫机能下降，从而易继发感染多种疾病。IBV可通过呼吸道和粪便快速传播，一周内可使整个鸡群感染，具有较高的发病率和病死率，严重阻碍了养禽业的健康发展［1］。

近年来不断有新发现的IBV毒株的报道，如2012年埃及报道了一株可引起严重的呼吸道和肾病变的新型IBV［2］；2013年意大利北部报道了可导致病鸡死亡率突增，并伴发肾组织坏死和腺胃炎的Q1株IBV［3］。临床研究发现广西新分离的8个IB毒株，与常规的Mass型疫苗株亲缘关系较远，起不到很好的免疫保护作用［4］，因此，传统的活疫苗已不能很好的控制该病的发生。目前，深入研究新的毒株和新型疫苗成为控制该病的重点。2004年，刘兴友等［5］发现一株对鸡和鸭均易感的IBV新型毒株（IBV ZZ2004），用 PK15细胞、Vero细胞和鸡胚成纤维细胞培养均未成功，目前仅能通过鸡胚接毒传代。通过用SPF鸡胚对该毒株低温诱导使其毒力减弱，获得弱毒株IBV ZZ-V35。经鉴定，IBV ZZV35具有良好的免疫原性和生物安全性，具有作为一种新疫苗毒的潜力。本研究旨在通过探针实时定量PCR方法检测IBV ZZ-V35在鸡胚尿囊液中的增殖规律，找出IBV弱毒在鸡胚中增殖量最高的时间点，为研究弱毒苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 IBV ZZ-V35由河南科技学院实验室保存。SPF鸡胚，北京梅里亚维通实验动物技术有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit 5.0、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、Prime-STAR HS DNA 聚合酶、pMD19-T 载体、DH5α化学感 受 态 细 胞、Premix EXTaq（Probe qPCR），TaKaRa公司产品；凝胶DNA快速纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒，OMEGA公司产品；西班牙琼脂糖。

1.2 方法

1.2.1 IBV ZZ-V35实时荧光定量PCR的建立 根据文献［6］IBV ZZ2004全基因序列（JF705860.1）设计一对特异性引物和一条TaqMan探针。引物序列为F1（上游引物）：5′-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3′，F2（下 游 引 物 ）：5′-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3′，P（探针引物）：5′（FAM）-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT（Eclipse）3′，扩增为N基因的一部分，其产物大小为117bp，由TaKaRa公司合成并标记，用TE缓冲液稀释到10nmoL／mL，置-20℃保存，备用。

1.2.2 RNA的提取及其反转录 将含IBV ZZV35弱毒的尿囊液反复冻融3次后，取含病毒的尿囊液200μL，按提病毒RNA试剂盒的步骤提取病毒RNA。用反转录试剂盒将病毒RNA合成cDNA。

1.2.3 阳性模板的制备 PCR反应体系总量为50μL：5× PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTPs（2.5mmol／L）4μL，上、下游引物F1、F2各1μL，PrimeSTAR HS DNA 聚 合酶1μL，cDNA 模板2μL，高压的去离子水31μL。反应条件为：95℃3min；94 ℃ 10s，68 ℃ 2min，35个循 环；68 ℃10min。PCR产物用15g／L的琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段回收；16℃过夜，连接pMD19-T载体；转化到DH5α感受态细胞内，涂板氨苄固体培养基37℃12h～14h；挑取单个菌落，于氨苄液体培养基37℃、170r／min摇床过夜，按照质粒提取说明书提取质粒，经PCR鉴定为阳性重组质粒，用蛋白核酸检测仪，测定浓度后，作为阳性模板。样品拷贝数（copies）＝（测得样品浓度×阿氏常数）／样品总分子量长度×660）。

1.2.4 实时定量RT-PCR标准曲线的建立 将已知浓度的标准阳性质粒经101～10710倍梯度稀释，每个稀释度设3个重复，Ct值为纵坐标，稀释倍数的对数为横坐标，建立标准曲线。荧光定量的反应体系为20μL，ExTaq（2x）10μL，上、下游引物各0.4μL，TaqMan探针0.8μL，Rox Reference DyeⅡ0.2μL，cDNA 模板2.0μL，高压去离子水6.2μL。荧光定量反应条件为：95℃20s；95℃3s，60℃32s，40个循环。

1.2.5 IBV ZZ-V35感染SPF鸡胚 孵化箱熏蒸消毒1h～2h，通风24h～48h，SPF鸡胚用1g／L的KMnO4表面消毒后，置于预热的孵化箱中。孵化条件为：37.8℃，湿度50%～60%，间隔2h自动翻蛋。弱毒尿囊腔原液经0.22μm滤膜过滤后，接种于11日龄SPF鸡胚0.2mL／枚，弃去24h死亡的鸡胚。孵化至36、48、52、56、60、64、68、72、76、80、88、96、120、144h分别取样。

1.2.6 感染样品的采集及cDNA的制备 每个时间点取接种IBV ZZ-V35弱毒株的SPF鸡胚3枚，无菌收集鸡胚尿囊液，反复冻融3次后，取病毒液200μL，按照提取病毒 RNA／DNA 试剂盒提取RNA，并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，用已建立的实时定量PCR方法对每个时间点的样品检测，然后计算IBV ZZ-V35在不同时间按的拷贝数，以及3重复样品之间的变异系数。

2 结果

2.1 阳性模板的制备

用设计的IBV ZZ-V35特异性引物，进行RTPCR扩增，结果显示扩增出一条约117bp的特异性条带，与预期结果一致（图1）。将PCR产物回收，连接pMD18-T载体，并转化到DH5α感受态细胞，挑取阳性重组质粒。经核酸蛋白测定仪，测得阳性重组质粒的浓度为206×10-6g／mL。

图1 RT-PCR产物电泳Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products

2.2 实时定量RT-PCR标准曲线的建立

IBV ZZ-V35的阳性质粒经实时定量PCR扩增，其扩增曲线和标准曲线见图2和图3。结果显示，所建立的IBV ZZ-V35实时定量PCR方法在10-2～10-7倍稀释范围呈良好的线性关系，Ct值范围是7.99～24.84，标准曲线的线性关系R2＝1，斜率为-3.277。log（copies／μL）＝（Ct-28.191）／-3.277。扩增效率（E%）为101.888。

图2 IBVZZ-V35TaqMan探针荧光定量PCR扩增曲线Fig.2 Amplification curve of IBVZZ-V35TaqMan quantitative real-time PCR

图3 IBV ZZ-V35TaqMan探针荧光定量PCR标准曲线Fig.3 Standard curve of IBV ZZ-V35TaqMan quantitative real-time PCR

2.3 IBV ZZ-V35在SPF鸡胚中的增殖规律

用建立的IBV ZZ-V35探针实时定量PCR方法检测感染该弱毒株不同时间的SPF鸡胚尿囊液中IBVZZ-V35的含量。检测结果显示，SPF鸡胚感染IBV ZZ-V3536、48、52、56、60、64、68、72、76、80、88、96、120、144h，尿囊液中病毒的平均拷贝数为1.416×106、1.791×106、2.056×106、3.027×106、3.664×106、1.854×106、1.380×106、1.109×106、7.976×105、5.408×105、2.958×105、2.512×105、4.365×104、1.130×104。变异系数为0.8%～2.1%。根据该弱毒株在SPF鸡胚尿囊液中的病毒拷贝数绘制曲线（图4）。

图4 IBVZZ-V35感染SPF鸡胚不同时间病毒的增殖曲线Fig.4 Proliferation curve of IBVZZ-V35in SPF chicken embryoes at different time post-infection

3 讨论

实时定量PCR技术不仅在基础研究和医学领域中广泛应用，在畜牧兽医学领域中也发挥了巨大的作用［7］。实时定量PCR技术分为相对定量和绝对定量。前者应用较多的是SYBR Green染料法，后者是TaqMan探针法。SYBR Green染料能够与所有的双链DNA结合，故易出现非特异性扩增而影响检测结果的可靠性和重复性。TaqMan探针是根据合成片段设计的特异性探针引物，具有高度的特异性和敏感性。申伟霞等［8］研究表明双重TaqMan探针实时定量PCR方法对H3、H9亚型流感病毒进行检测，敏感度分别提高了100倍和1 000倍。Meir R等［9］研究表明TaqMan探针荧光定量可高效快速的检测出临床样本中IBV。张鹳晓等［10］采用TaqMan探针方法可快速、敏感、特异的检测到活禽中新城疫病毒中强毒株。梁耀峰等［11］TaqMan探针方法建立了IBV H52株的定量的检测方法，比常规PCR敏感性高10倍。上述均表明了TaqMan探针方法具有明显的特异性和敏感性，可作为病毒定性和定量的有效手段。

本研究主要通过TaqMan探针实时定量RTPCR方法绘制了IBV ZZ-V35在SPF鸡胚中的增殖曲线，证明在52h～64h病毒的拷贝数较高，60h达到峰值，以后逐渐下降。这可能是由于通过鸡胚传代致弱的毒株，在鸡胚中的适应性逐渐上升，48h后鸡胚死亡率有所上升，但此时弱毒株的增殖也趋于上升阶段，但是随着鸡胚的生长，抵抗力增强，病毒的复制也出现下降趋势，表现在64h后病毒增殖明显下降。该毒株在细胞上培养还未获得突破性的进展，通过鸡胚尿囊液扩增病毒是其主要手段。通过TaqMan探针实时定量PCR能够精确的检测到鸡胚尿囊液中病毒的含量，为传染性支气管炎病毒ZZ-V35弱毒株的研究提供了依据，更为今后IBV弱毒疫苗的研究奠定了基础。

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