雄激素受体基因CAG多态性对前列腺癌恶性程度的影响

梁国庆, 顾燕青, 沈 薇, 陈伟杰, 江宁东, 陈春雷, 沙建军

(1.上海中医药大学附属市中医医院泌尿外科,上海 200071；2.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院泌尿外科,上海 202150；3.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科, 4.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科,上海 200127)

·基础研究·

雄激素受体基因CAG多态性对前列腺癌恶性程度的影响

梁国庆1, 顾燕青2, 沈 薇3, 陈伟杰1, 江宁东1, 陈春雷1, 沙建军4

(1.上海中医药大学附属市中医医院泌尿外科,上海 200071；2.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院泌尿外科,上海 202150；3.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科, 4.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科,上海 200127)

目的 检测正常人群、前列腺癌(PCa)低危和高危组雄激素受体(AR)基因(CAG)n微卫星多态性，探讨该重复序列长度对PCa恶性程度的影响。方法 应用PCR和双链循环DNA测序技术，对98例正常人群(对照组)和95例经前列腺穿刺活检证实为PCa的患者，进行外周血标本(CAG)n串联重复序列检测，分析该微卫星多态性与PCa恶性程度的影响。 结果 PCa组CAG重复序列为15～31，平均(23.21±3.07)；参照组重复序列为14～34，平均(24.20±3.50)，两者比较差异具有显著统计学意义(P<0.05)。根据PCa患者肿瘤Gleason评分进行分级，≤7分为低危，共68例，≥8分为高危，27例。低危组的CAG重复序列为18～31，平均(23.65±2.92)，高危组CAG重复序列为15～27，平均(22.11±3.21)，两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)，高危组与参照组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。 结论 受试者AR基因(CAG)n重复序列呈现多态性，该重复序列长度与PCa的发生有关，较短的CAG重复序列预示发生PCa的可能性较大，恶性程度更高。

基因；多态性；CAG重复序列；雄激素受体；前列腺癌；恶性程度

前列腺癌( prostate cancer, PCa)是老年男性的常见恶性肿瘤，其发病机制尚未完全明了，目前认为，遗传因素是其最重要病因之一。基因组学研究发现，57%的PCa发病病因取决于其基因方面的因素[1]。雄激素受体(androgen receptor, AR)基因的过表达可以引起PCa的发生和发展[2]。本研究采用PCR和双链循环DNA测序方法进行外周血标本AR基因CAG 串联重复序列(CAG short tandem repeat, CAG-STR)检测，探讨CAG重复序列长度与PCa恶性程度的相关性，为基因水平筛选PCa易感人群寻找理想的分子标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 95例PCa患者和98例正常男性(参照组)血样标本均来自上海交通大学医学院附属仁济医院和上海市中医医院泌尿外科。PCa患者均经前列腺穿刺活检病理证实，年龄47～86岁，中位年龄64岁，按照PCa肿瘤的Gleason评分进行分级，8～10分为高危组计27例，≤7分为低危组68例。对照组人群年龄51～65岁，中位年龄58岁。

1.2 基因组DNA 提取及引物设计与合成 静脉采血10 mL注入含EDTA的试管内，运用厦门百维信生物科技有限公司提供的试剂盒提取DNA。PCR方法扩增AR基因外显子1 NH2端转录调节区350 bp片段，引物设计采用Primer 5.0软件完成，由英潍捷基上海贸易有限公司合成，上游引物序列： 5′-CAGTTAGGGCTGGGAAGGGTC-3′，下游引物序列：5′-TGCGGCTGTGAAGGTTGCT-3′。

1.3 PCR反应 总体积为 25 μL，内含2×PCR缓冲液，终浓度为200 μmol/L的dNTP，终浓度为2 mmol/L 的MgCl2，引物终浓度为0.5 μmol/L，模板DNA约200 ng，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)1.25 U。扩增条件: 95 ℃预变性，2 min后进入循环(96 ℃变性30 s，65 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次)，72 ℃再延伸4 min。

1.4 目的片段测序 PCR产物用10 μL载样缓冲液，混匀，加于8 g/L琼脂糖凝胶(含溴乙锭)中电泳后，紫外灯下切取特异性的PCR条带。扩增片段送北京六合华大基因公司上海测序部检测(CAG)n双链DNA循环序列。

2 结 果

2.1 AR基因CAG重复序列长度 由图1 显示，三组对象共193例CAG重复次数介于14～34，平均23.72±3.32，中位数为23.0，与文献报道一致[3]。

2.2 CAG重复序列长度与PCa恶性程度的相关关系 三组CAG 重复序列长度比较(表1)，分别为对照组(98例，24.20±3.50)，PCa组(95例，23.21±3.07)；其中低危组(68例，23.65±2.92)，高危组(27例，22.11±3.21)，对照组长度高于PCa组(P<0.05)，PCa高危组长度显著低于对照组(P<0.01)，PCa高危组长度则低于PCa低危组(P<0.05)，但对照组与PCa低危组比较，差异变化没有统计学意义(P >0.05)。

图1 AR 基因CAG 重复序列长度分布条状图

表1 三组间CAG 重复序列长度比较

与对照组比较,*P>0.05；与低危组比较,#P <0.05；与高危组比较,ΔP<0.01。

3 讨 论

AR是雄激素的主要分子靶标，通过与雄激素结合并作用于相应的靶组织和器官而发挥效应，所以AR是介导雄激素作用的关键分子基础。AR是类固醇激素受体家族的一员，其编码基因位于X 染色体的q11～12区，由8个外显子和7个内含子组成。AR的一级结构分为三个不同功能区：①具有转录激活功能的N-端区(N-terminal domain, NTD)；②与靶基因上雄激素反应元件(androgen response element, ARE)特异性结合的DNA结合区(DNA binding domain, DBD)；③C端的配体结合区(ligand binding domain，LBD)。AR的转录活性细微调节由其第一外显子1 NH2重复序列(CAG)n编码，即CAG重复次数(n值)与AR的转录活性呈现负相关，n值越小，AR的转录活性越强大[3]。AR基因(CAG)n编码谷氨酰胺重复序列数量在16～29时，方能维持AR分子结构以及AR与协同因子间的正常作用，但伴随着重复序列的增加，AR与其协同因子的作用将受到抑制，导致AR信号传导通路出现异常[4]。

前列腺是雄激素依赖性器官，AR存在于成人前列腺间质细胞和腺上皮细胞的细胞核内，AR信号系统对前列腺的生长、发育以及维持其功能起着至关重要的作用[5]。AR通过直接与DNA序列结合，调节相关基因的表达，在男性生殖器官的形成、第二性征发育、蛋白质合成代谢、骨骼和肌肉发育等方面发挥着重要功能[6-7]。研究显示，PCa与AR的表达改变存在着某些关联，AR的过量表达将促进前列腺上皮细胞增殖，最终导致PCa的发生[8]。尽管目前对于PCa组织中AR表达情况的研究结果并不统一，但AR在PCa疾病的激素依赖向激素非依赖性的转化过程中存在着重要作用却是具有共识的[9]。在PCa发生的早期阶段，AR的表达较BPH组织显著增加，但伴随肿瘤临床分期的增高，AR的表达却呈递减趋势，甚至低于BPH组织中[10]。

有研究证实，AR基因(CAG)n多态序列长度与冠心病[11]、妇女乳腺癌[12]和中老年男性迟发性性腺功能减退症[13]等多种疾病的发生有关。TONG等[14]研究了中国汉族PCOS妇女时发现，PCOS人群(CAG)n重复序列长度明显短于正常人群，提示较短CAG者AR的表达量增加，组织对雄激素敏感性增强，较长CAG重复序列者AR表达量减少，雄激素敏感性下降。最新研究发现，短的(CAG)n(n≤24)重复序列与印度男性PCa和BPH疾病的发生有关[15]。

本研究结果显示，受试者(CAG)n重复数分布呈现多态性，分布范围为14～34。PCa组的CAG-STR重复次数(n值)低于参照组(P<0.05)，PCa高危组的长度亦低于PCa低危组(P<0.05)，而参照组的CAG重复长度则显著高于PCa高危组(P<0.01)，PCa低危组长度略低于参照组，但差异没有统计学意义(P>0.05)。此研究提示较短的CAG重复序列可能使前列腺上皮细胞更容易受到损伤，从而增加了PCa疾病的易患性。CAG-STR重复次数的减少将降低AR基因的转录活性，使雄激素的作用不能很好发挥。由此可以推断，AR基因的CAG重复序列长度可能是PCa发病的危险因素，CAG重复序列越短，则发生PCa疾病的可能性越大，PCa的恶性程度更高。

关于基因多态性与PCa易患性的研究，各研究者的结论仍存在着诸多争议，可能源于受试者人种的差异、生物学差异及实验者的实验技术、统计方面局限性等因素的影响。需要进一步统计全面的大样本、多中心研究，以期明确基因多态性与PCa易患性之间更直观全面的关联。

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(编辑 何宏灵)

Effect of androgen receptor gene (CAG)npolymorphism repeats on the severity of prostate cancer

LIANG Guo-qing1, GU Yan-qing2, SHEN Wei3, CHEN Wei-jie1, JIANG Ning-dong1, CHEN Chun-lei1, SHA Jian-jun4

(1.Department of Urology, Shanghai Municipal Hospital of TCM Affiliated to Shanghai Traditional Chinese Medical University, Shanghai 200071; 2.Department of Urology, Chongming Branch of Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 202150;3.Department of Laboratory Medicine; 4.Department of Urology, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China)

Objective To screen the (CAG)npolymorphism of androgen receptor (AR) gene in healthy men, patients with mild prostate cancer (PCa) and severe PCa, and to explore the relationship between the polymorphism with PCa severity.Methods A total of 98 healthy men (control group) and 95 PCa patients were enrolled. The length of AR gene CAG short tandem repeat (CAG-STR) sequences were detected by PCR and dsDNA cycle sequencing, and the effect of (CAG)npolymorphism on PCa severity was analyzed. Results The number of CAG repeats for the PCa group and the control group were 15～31 (23.21±3.07) and 14～34 (24.20±3.50) respectively, with statistically significant difference between them (P< 0.05). According to PCa Gleason level, 68 cases were mild PCa (≤7) and 27 cases were severe PCa (≥8). The number of CAG repeats for the mild and severe PCa groups were 18～31(23.65±2.92) and 15～27(22.11±3.21), respectively, with a significant difference. The number of CAG repeats in the severe PCa group was fewer than that in the control group (P< 0.01). Conclusions The length of AR gene CAG repeat sequences present polymorphism in the subjects and may be one of the risk factors for PCa. Shorter CAG repeat sequences suggest severer PCa.

genes; polymorphism; (CAG)nsequence repeat; androgen receptor; prostate cancer; severity degree

2014-11-10

2015-01-14

上海市卫生局课题(No.20134392)

沙建军，主治医师. E-mail: shajianjunrj@126.com

梁国庆(1977- )，男(汉族)，硕士学位，主治医师，从事泌尿外科和男科学专业工作.E-mail: applessw@163.com 顾燕青(1977-)，男(汉族)，学士学位，主治医师，从事泌尿外科专业.E-mail: gyqsnake1996@126.com, 系共同第一作者.

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.06.016