高效液相色谱梯度洗脱法测定水杨酸复合洗剂中的有关物质

2015-06-24郭旭光郑子栋郭毅

医药导报 2015年5期

关键词：量瓶苯甲酸水杨酸

郭旭光，郑子栋，郭毅

(河南省食品药品检验所，郑州 450003)

高效液相色谱梯度洗脱法测定水杨酸复合洗剂中的有关物质

郭旭光，郑子栋，郭毅

(河南省食品药品检验所，郑州 450003)

目的建立梯度洗脱的高效液相色谱(HPLC)法测定水杨酸复合洗剂中的有关物质。方法采用Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.5%磷酸溶液(A)、甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为270 nm，柱温为35 ℃。结果该方法可快速有效分离水杨酸复合洗剂中各有关物质。结论该方法准确、灵敏、快速、专属性强，可以用于控制该产品质量。

水杨酸复合洗剂；梯度洗脱；色谱法，高效液相

水杨酸复合洗剂具有止痒、杀菌的作用，用于真菌感染的手、足癣的治疗，疗效好，价格便宜。现行水杨酸复合洗剂的质量标准没有对其有关物质进行检定[1]，笔者参考相关文献采用高效液相色谱梯度洗脱法对水杨酸复合洗剂的有关物质进行了测定[2-10]，本方法快速，简便，准确，可以更好地控制该产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);G1314A VWD可变波长检测器(美国Agilent公司)；Agilent chem Station色谱工作站。

1.2 试药苯甲酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100419-200301，含量：100%)，水杨酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100106-201104，含量：100%)，4-羟基苯甲酸对照品(Acros公司，批号：A0282187，含量：99.8%)，4-羟基异酞酸对照品(东京化成工业株式会社，批号：DLTTC，含量：99.4%)，苯酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100509-200902，含量：100%)，水杨酸复合洗剂(市售，批号：130101，130102，130103)，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为0.5%磷酸溶液，流动相B为甲醇，线性梯度洗脱程序见表1；柱温：35 ℃；流速为1.0 mL·min-1，检测波长为270 nm；进样体积为10 μL。

2.2 系统适用性实验取苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸及苯酚对照品适量，置同一量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解稀释制成浓度为16 μg·mL-1的溶液，作为系统适用性溶液，按上述色谱条件测定。结果表明，相邻峰的分离度均>1.5。

表1 梯度洗脱程序

2.3 专属性实验

破坏性实验储备液的制备：精密称取粉剂300 mg，置20 mL量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解，稀释至刻度，摇匀。

酸破坏：精密量取储备液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1盐酸1 mL放置2 h后用1 mol·L-1氢氧化钠调pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定。

碱破坏：精密量取储备液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1氢氧化钠1 mL放置2 h后用1 mol·L-1盐酸调pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定。

氧化破坏：取储备液2 mL，置5 mL量瓶中，加30%过氧化氢1 mL，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，放置0.5 h后，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定。

高温破坏：取储备液2 mL，置5 mL量瓶中，60 ℃水浴2 h，放至室温，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定。

光照破坏：取储备液2 mL，置5 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，于4 000 lx光照2 h，放至室温，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定。

结果各破坏条件下的降解物与主峰分离均良好。

2.4 线性范围考察精密称取苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚对照品各20 mg置同一50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取0.5，2.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL分别置10 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以浓度C(μg·mL-1)对峰面积A进行线性回归，分别得苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚的线性回归方程：

A=2.720 4C+0.320 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.479 5C+0.675 4，R2=0.999 6(n=6)；

A=63.047C+6.185 5，R2=0.999 8(n=6)；

A=37.58C-3.457 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.292 3C+0.459 6，R2=0.999 8(n=6)。

结果表明，苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚分别在2.109～37.962 μg·mL-1、1.989～35.802 μg·mL-1、1.982～35.676 μg·mL-1、2.018～36.324 μg·mL-1和2.234～40.212 μg·mL-1范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验取“2.2”项下的系统适用性实验溶液，分别连续进样6次，按“2.1”项色谱条件进行分析，记录色谱图，测得苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚峰面积的RSD 分别为0.8%，0.5%，0.6%，0.5%和0.4%，结果表明此法精密度良好。

2.6 重复性实验精密称取水杨酸复合洗剂(批号：130101)6份，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定6份样品有关物质总峰面积、杂质个数、单个杂质量、杂质总量。结果总峰面积平均值为14 536.5，RSD为0.9%；杂质个数均为5个；单个杂质量基本没有变化；杂质总量平均值为0.55%，RSD为0.2%。

2.7 检测限和定量限以信噪比为3：1，测得苯甲酸、水杨酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚检测限分别为4.22，3.98，0.124，0.448和4.47 ng；定量限分别为12.78，12.06，0.37，1.49和13.45 ng。

2.8 溶液稳定性选取2批样品(批号：130101，130102)进行考察。结果显示，供试品溶液在常温下放置24 h，2批样品的杂质峰数目、单个杂质的峰面积和杂质总量均无变化(RSD=0.04%)，说明溶液在常温下24 h内稳定。

2.9 耐用性选用2根不同品牌的C18柱，Agela Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，在2台仪器(Agilent 1100型高效液相色谱仪和Waters 2695型高效液相色谱仪)上测定3批样品的有关物质，发现不同色谱柱检测到的杂质数目、出峰顺序、分离效果和峰面积均无明显变化。

2.10 样品测定取本品适量，精密称定，用0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液定量稀释制成每毫升中含水杨酸约2 mg的溶液，摇匀，用孔径0.2 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液稀释至刻度，摇匀，经孔径0.2 μm滤膜滤过，将滤液作为对照溶液。按上述色谱条件测定，分别取对照溶液及供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰的峰面积不得大于对照溶液中水杨酸主峰面积的0.5倍；各杂质峰的面积之和不得大于对照溶液中水杨酸峰面积的3倍。用自身对照法计算各杂质的含量，3批有关物质均符合规定，见表2。

3 讨论

笔者比较了4种不同流动相系统：①甲醇-水-冰醋酸(60：40：1)[2]；②甲醇-水-冰醋酸(40：60：1)[3]；③20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(用20%磷酸调节pH为2.7)-甲醇(40：60)；④以0.5%磷酸溶液

表2 有关物质测定结果 %

(A)、甲醇(B)为流动相，梯度洗脱。结果流动相①、②和③部分色谱峰的分离度<1.5，并且基线较高且有漂移，半峰宽较大，峰拖尾因子不理想，水杨酸峰后出现一较大宽峰；采用流动相④梯度洗脱后基线漂移现象得到改善，水杨酸后的大宽峰得以改善，主峰及各杂质峰之间均分离良好；笔者尝试用0.5%三氟乙酸溶液和0.5%醋酸溶液替代流动相④中的0.5%磷酸溶液进行梯度洗脱实验，结果流动相A为0.5%三氟乙酸溶液时图谱中各峰的分离度均>4.0，分离度较好且柱效高，但是基线噪音大；用0.5%醋酸溶液以同样梯度洗脱，结果苯甲酸和水杨酸分离不完全。尝试改变梯度程序，主峰保留时间、检出杂质峰个数及分离度均有所不同，综合考虑以上因素并结合柱效和拖尾因子，最终确定流动相④的梯度洗脱程序最优，笔者选择流动相④梯度洗脱作为该产品流动相系统。

分别精密称取两份水杨酸复合洗剂样品(批号：130101)分别用溶剂A[0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液]和溶剂B(50%甲醇)稀释制成每毫升含水杨酸约2 mg的溶液，按本文色谱条件进样，结果溶剂B稀释的样品色谱图中苯甲酸和水杨酸两主峰分离不完全；用溶剂A稀释后的色谱图，主峰之间及与杂质峰均分离完好，故确定溶剂A为本文方法溶剂。

采用DAD检测器对供试品溶液色谱图中的各杂质峰和主峰的最大紫外吸收进行测定，经实验图谱中各峰的紫外吸收主要集中在254，270和230 nm附近，在这3个波长处，各杂质的吸收大小程度不同，分别对同一份供试品进行有关物质测定，结果表明在270 nm波长处单个杂质峰的面积百分比均较大，检出的总杂质量最多，为了更多地检出杂质，更有效地控制该产品质量，选择270 nm为有关物质检测波长。

本品的药效成分是苯甲酸、水杨酸、硼酸和乳酸。苯甲酸和水杨酸具有紫外吸收，笔者依此并参考相关文献建立了高效液相色谱梯度洗脱法测定其有关物质[2-10]，因硼酸和乳酸没有紫外吸收，其有关物质暂时还没有检测方法；4-羟基苯甲酸、4-羟基异酞酸和苯酚均为已知杂质，含量均<0.5%，其他杂质检出量均非常微小，本研究共检出两个单个未知杂质，其结构和归属有待进一步研究，两个未知单个杂质均暂以主成分水杨酸峰面积计算。参照《中华人民共和国药典》[2]水杨酸原料标准中对杂质A(4-羟基苯甲酸)、杂质B(4-羟基异酞酸)、杂质C(苯酚)的限度规定，确定本品单个杂质的限度不超过0.5%，以更好地控制该产品质量。

破坏性实验表明本品在强酸碱和氧化条件下均有降解，光破坏和高温破坏几乎没有降解，说明储存过程中要避免强酸碱条件并应密封保存，考虑到苯甲酸和水杨酸均为小分子物质，降解后可能没有紫外吸收，所以有关物质和含量测定相结合以进行质量评价更有意义。

[1] 国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准(第13册)[S].北京：中国医药科技出版社，1998：75.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：78-79.

[3] The United States Pharmacopeial Convention.USP34-NF29[M].Maryland：the United States Pharmacopeial Convention，2011：4194-4195.

[4] European Directorate for Quality Medicines.EP7.2[M].Strasbourg：European Directorate for Quality Medicines，2011：2884-2885.

[5] 黄洁，李锋武，刘鹏鸣，等.HPLC法测定水杨酸原料药的有关物质[J].药物分析杂志，2011，31(11)：2182-2184.

[6] 李慧敏.HPLC法检测口服液类保健食品中苯甲酸和山梨酸的含量[J].中国药事，2013，27(1)：38-40.

[7] 章家伟，王辉，孙庆荣，等.RP-HPLC法同时测定苯甲酸原料药中有关物质苯甲醛和甲苯的含量[J].中国药房，2013，24(29)：2754-2757.

[8] 何秀峰，夏鹏飞，王爱国，等.水杨酸甲酯乳糖苷有关物质测定方法的研究[J].中国新药杂志，2013，22(11)：1259-1262.

[9] 熊苗苗，汪秋兰，施春阳，等.高效液相色谱法测定复方磷酸哌喹片的有关物质[J].医药导报，2013，32(1)：75-77.

[10] 付桂英，李秀青，孙燕，等.HPLC法测定水杨酸软膏中主药及有关物质的含量[J].中国药房，2009，20(16)：1257-1258.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.026