PRDX 1在食管鳞癌中的表达及其临床意义*

吴建平，蒋芳，俞力，潘晓晖

(上海市闸北区中心医院消化内科，上海闸北区 200070)

PRDX 1在食管鳞癌中的表达及其临床意义*

吴建平，蒋芳，俞力，潘晓晖

(上海市闸北区中心医院消化内科，上海闸北区 200070)

目的:检测PRDX1蛋白在食管鳞癌中的表达，并分析其表达异常与临床病理学参数之间的相关性。方法:构建含144例食管鳞癌的组织芯片，免疫组化检测PRDX1蛋白的表达，统计学分析其临床意义及食管癌患者总生存期之间的关系。利用PRDX1 shRNA敲降PRDX1表达，MTT法观察癌细胞增殖能力的变化。结果:免疫组化结果显示PRDX1在食管鳞癌中的表达率为66．7%(96/ 144)，而癌旁粘膜中呈弱表达。PRDX1的高表达与淋巴结转移和疾病进展呈正相关。单因素生存分析表明PRDX1蛋白阳性表达患者较阴性患者预后更差。而PRDX1的下调表达可抑制食管癌细胞的增殖。结论:PRDX1在食管鳞癌的发生进展过程中发挥了重要作用，是食管鳞癌患者治疗的潜在靶点之一。

食管鳞癌;PRDX1;生存分析

我国是世界上食道癌死亡率较高的国家之一，随着对食道癌研究的深入，食道癌的疗效和预后有一定程度的提高，但依然存在较高的发病率和死亡率，尤其是晚期食管癌患者，其5年生存率不到5%［1］。PRDX1是一种抗氧化酶，其不但可以对于H2O2介导信号起到调节以及抗氧化的作用，还能直接或者间接地参与到多种可能与氧化有关的生理病理过程，发挥其分子伴侣的功能［2，3］。近年来，研究发现PRDX1在肿瘤中异常表达，PRDX1的过度表达促进了肿瘤细胞的增殖，而在食管鳞癌中的研究相对罕见。本研究以蛋白水平研究为着手，着重研究PRDX1在食管鳞癌中的相关表达，并观察其对食管癌细胞的功能学影响。

1 资料与方法

1．1 组织标本:收集2005年至2014年部分患者的食管鳞癌标本，并对含有食管鳞癌原发灶或者部分对应癌旁非肿瘤组织进行相关组织芯片的构建。共收集患者144例，其中男性90例，女性54例。60岁及60岁以下69例，60岁以上75例，中位年龄59．5岁。患者术前均未接受过放化疗相关治疗。

1．2 免疫组化实验

1．2．1相关抗体:兔抗PRDX1(EPR5434)抗体(EPITOMICS公司，稀释比例为1:100)。免疫组化技术采用S－P法(试剂盒由上海凯捷公司购入)，PBS作阴性对照。

1．2．2 判定标准:PRDX1定位于细胞浆，其阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色。根据二级积分法的技术方法，以阳性细胞所占5个以上高倍镜视野比例作为计数依据，共分为四种评分方式:占5%～25%为1分;占25%～50%为2分;占50%～75%为3分;而对于占＞75%的计数评分为4分。此外根据染色强度对其进行分类:其中淡黄色为1分;黄或深黄色为2分;褐或棕褐色为3分。将两组计分进行乘积，结果大于1者则为阳性。

1．3 细胞培养和转染

1．3．1 细胞培养:将人食管癌细胞株EC109(上海大学生命科学院)放置于控温37℃，在含5%CO2的孵箱中进行培养。培养液则采用胎牛血清(10%)的DMEM。

1．3．2 细胞转染:构建sh－PRDX1表达载体，按照相关说明书(LipofectAmine 2000)进行。EC109细胞株首先接种于六孔板中，并放置24h，以使其在转染时能够达到75%～85%;使用DMEM分别对质粒与LipofectAmine 2000进行稀释，随后在室温条件下放置5min，并将两者进行混匀。混匀后静止放置20min;随后将混匀物加入到EC109细胞中。在37℃的温度下进行孵育。孵育6h后，更换完全DMEM培养基并继续进行培养;在24h后进行消化传代。其中部分用于相关蛋白的提取，另外部分则用于相关细胞的增殖。

1．3．3 Western印迹杂交:PBS冲洗2次后快速加入蛋白裂解液进行冰上裂解，裂解进行10min后，将其移入移液管(1．5mL)，在4℃温度下进行超速离心。30min后提取上清液，并使用BCA法进行相关蛋白定量。采用SDS－PAGE胶(10．5%)对蛋白样品进行分离，将250mA电流进行转移至硝酸纤维素膜(约2h)。使用脱脂奶粉(5%)进行封闭1h;TBST稀释PRDX1一抗(1:1000)，并在4℃温度下放置过夜;TBST则进行3次洗膜，每次约10min;在室温下使用TBST稀释HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000)，放置1h后进行洗膜3次，使ECL显色。

1．3．4 细胞增殖:EC109细胞经过转染，等待24h后，进行胰酶消化的计数，按照说明书在每孔以1×104个细胞接种于96孔培养板，每组设6个平行孔，于37℃、5%CO2孵箱中进行培养。每日取1块培养板进行提取，早每孔加入浓度为5mg/mL的MTT10ul，经过4h培养后弃去培养液，并在每孔加入150ul的DMSO，反复进行振荡后使用酶标仪在570nm处进行OD值检测。分别取6孔数据，并进行均数处理。随后以时间为横轴，OD值为纵轴进行绘图。

1．4 统计学分析:采用SPSS17．0对研究进行统计。其中t检验用于计量资料的统计;采用χ2检验进行技术资料的统计;生存分析采用Kaplan－Meier和COX多元回归分析。

2 结果

2．1 PRDX1的相关表达:通过免疫组化试验后，其结果显示PRDX1染色呈淡黄至棕黄色，分别在食管鳞状上皮组织呈微弱着色(图1A，B)，并在肿瘤中呈弥漫、片状的相关分布(图1C－F)，部分肿瘤组织不着色或呈微弱阳性(图1G，H)PRDX1在食管鳞癌中的表达率为66．7%(96/144)。

图1 PRDX1在食管鳞癌中的表达。A，B:PRDX1在癌旁组织中的阴性染色;C－F:PRDX1在原发癌中的阳性染色;G，H:PRDX1在原发癌中的微弱表达;A，C和E:IHC×10倍;B，D和F:IHC×400倍。

图2 PRDX1表达和总生存时间之间的关系。

图3 下调PRDX1对食管癌细胞增殖能力的改变

2．2 PRDX1与临床病理:根据统计学相关分析显示，PRDX1的表达呈阳性与患者的基本资料(性别、年龄)以及肿瘤的大小、浸润深度并无显著的关联，而与淋巴结转移和疾病进展呈正相关。见表1。

表1 PRDX1与临床病理参数之间的关系

2．3 生存分析:单因素分析发现PRDX1阳性患者的生存期为55．1个月，阴性患者为71．8个月，χ2=12．911，P=0．047(图2)。此外，肿瘤大小(≤6cmvs＞6cm: 65．3vs38．1月，P=0．009)，浸润深度(T1/T2vsT3/T4: 86．7vs43．6月，P＜0．001)，组织分化(高中分化vs低未分化:70．9vs37．8月，P＜0．001)、淋巴结转移(有vs无:，45．7vs84．1月，P＜0．001)和TNM分期(Ⅰ/ⅡvsⅢ/Ⅳ:89．5vs35．1月，P＜0．001)也与患者的相关预后相关。若将上述因素共同纳入Cox进行多元回归分析，其结果显示组织分化和TNM分期是能够判断食管鳞癌患者其预后程度的独立因素。详见表2。

2．4 PRDX1下降表达对食管癌细胞增殖的影响:敲降PRDX1后24和72h测EC109的增殖情况，我们发现PRDX1的下降表达能够明显抑制食管癌细胞的增殖(图3)。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展以及治疗方式的演进，食管癌患者的治疗效果和生活质量有了显著提升。然而食管癌恶性程度较高，起病迅速，病程进展较快，食管癌患者的5年生存率未见显著提高。因此，深入研究食管癌的发病机理，加快食管癌基础与临床转化研究，有助于提高食管癌治疗疗效和改善食管癌患者预后。近年来，较多研究显示氧化损伤和能量代谢异常等促进了哺乳动物细胞的恶性转化。其中PRDX1作为一种抗氧化酶，直接或间接地参与体内多种与氧化相关的生理病理过程，包括参与了肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移。然而目前关于PRDX1的研究存在争议，大部分研究发现其在人实体瘤中高表达，如乳腺癌、胆管癌、舌鳞癌、肠癌和肺癌等［4～6］，但也有研究显示在部分实体瘤中PRDX1表达缺失，如食管癌等。为了进一步明确PRDX1在食管癌中的表达谱系，我们进行了本次研究。

Hoshino等检测了114例食管鳞癌中PRDX1的表达，结果发现PRDX1在20%的标本中不表达或弱表达，50%中度表达，36%呈高表达，且PRDX1表达与食管癌恶性生物学行为如T分期、淋巴结转移和分期呈负相关，低表达PRDX1患者预后要劣于高表达PRDX1患者，进而提出PRDX1具有抑癌基因功能［7］。与之相反，我们的结果显示正常组织中PRDX1呈微弱表达，而食管鳞癌组织中PRDX1蛋白表达显著升高，且见于66．7%的食管癌患者。而在进一步相关研究中，PRDX1的过度表达往往与食管癌的恶性生物学行为具有极为密切的关联。存在淋巴结转移的食管鳞癌中的PRDX1的表达率高达74．0%，远远高于不存在淋巴结转移的食管鳞癌中的52．1%。而随着疾病的进展，PRDX1表达率也随之进展升高，在Ⅲ和Ⅳ期的患者中PRDX1表达率则高达75．9%，远高于I和Ⅱ期患者的54．1%。该结果与乳腺癌和舌鳞癌中的研究较为一致，肿瘤中PRDX1呈高表达状态，且其高表达与肿瘤复发或疾病进展相关［4，5］。

Yanagawa等研究显示PRDX1过表达的鳞癌患者更加易于复发［5］。而在本研究中，单因素生存分析结果显示:PRDX1过表达食管癌患者的总生存期低于PRDX1低表达的患者，但多因素回归分析未显示PRDX1与TNM分期和组织分化一样是判断食管癌患者预后的独立因素。既往研究显示，患者的机体状态、手术因素、病理因素和遗传学因素等都会影响食管癌患者的预后，因而，还需要大样本前瞻性工作加以验证PRDX1能否应用于临床，并结合其他因素加以分析。

进而我们研究了PRDX1对于食管癌细胞增殖能力的影响。PRDX1－shRNA敲降PRDX1后，我食管癌细胞EC109的增殖能力明显下降，提示了我们PRDX1可能参与了的食管癌细胞的增殖机制。这与Riddell等在前列腺癌中的相关研究非常类似，其下调了PRDX1的表达通过抑制肿瘤血管形成和VEGF的表达进而抑制前列腺癌细胞的增殖。上述数据表明PRDX1参与了食管鳞癌的发生和发展，但PRDX1能否作为治疗的靶点还有待于深入研究。

表2 影响食管鳞癌预后的多因素分析

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，etal．Global cancer statistics［J］．CA Cancer Clin，2011，61(2):69～90．

［2］Rhee SG，Kang SW，Chang TS，et al．Peroxiredoxin，a novel family of peroxidases［J］．IUBMB Life，2001，52(1～2): 35～41．

［3］Hofmann B，Hecht HJ，Flohe L．Peroxiredoxins［J］．Biol Chem，2002，383(3～4):347～364．

［4］Cha MK，Suh KH，Kim IH．Overexpression of peroxiredoxin Iand thioredoxin1 in human breast carcinoma［J］．Exp Clin Cancer Res，2009，28:93．

［5］Yanagawa T，Omura K，Harada H，et al．Peroxiredoxin I expression in tongue squamous cell carcinomas as involved in tumor recurrence［J］．Int Oral Maxillofac Surg，2005，34 (8):915～920．

［6］Yonglitthipagon P，Pairojkul C，ChamgramoL Y，et al．Prognostic significance of peroxiredoxin 1 and ezrin－radixinmoesin－binding phosphoprotein 50 in cholangiocarcinoma［J］．Hum Pathol，2012，43(10):1719～1730．

［7］Hoshino I，Matsubara H，Akutsu Y，et al．Tumor suppressor PRDX1 is a prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma patients［J］．Oncol Rep，2007，18(4):867～871．

Expression of PRDX1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and the Significance

WU Jianping，JIANG Fang，YU Li，et al
(The Central Hospital of Zhabei District，Shanghai Zhabei District 200070，China)

Objective:To detect PRDX1 expression and determine the clinical significance in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)．Method:Tissue microarray blocks containing tumor specimens obtained from 144 patientswith ESCC were constructed．Expression of PRDX1 in human ESCC specimenswas analyzed by using immunohistochemistry．cells were transfected with sh－PRDX1 and cell proliferation was analyzed by MTT assay．Result:IHC results showed that expression of PRDX1 was observed in 96 cases (66．7%)of 144 primary tumors．PRDX1 expression was significantly associated with tumor invasion，lymph nodemetastasis，tumor progression and poor differentiation．PRDX1 expression significantly correlated with poor outcome of patientswith ESCC in univariate analysis．Knockdown PRDX1 leaded to the inhibition of cell growth．Conclusion:PRDX1 has played an important role in the process of esophageal squamous cell carcinomas，and itwill be the one of the potential targets for treatment of esophageal squamous carcinoma．

ESCC;PRDX1;Survival analysis

B

10．3969/j．issn．1006－6233．2015．08．013

上海市卫生局科研课题，(编号:20114628)

1006－6233(2015)08－1408－04