大菱鲆造血器官肿大病的病原分离、鉴定及药物敏感性

邓威等

摘 要：从患造血器官肿大病大菱鲆（Scophthalmus maximus）肾脏中分离到菌株NY79，对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rRNA等综合分析，鉴定NY79为迟缓爱德华氏菌。NY79菌株对健康大菱鲆进行人工感染的试验发现，感染发病症状与自然发病症状一致， 每条鱼的LD50为2.4×104 cfu，表明迟缓爱德华氏菌为大菱鲆造血器官肿大病的病原。药敏试验发现，NY79对阿莫西林等17种药物敏感，对红霉素等4种药物具耐受性。

关键词：大菱鲆；迟缓爱德华氏菌；人工感染；药物敏感性

中图分类号：S965.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.011

Abstract：The dominant bacterial strain， designated as NY79，was isolated from kidney which was diseased hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. The biochemical and physiological characteristics of the isolated strain was studied by conventional method， such as 16SrRNA. The result confirmed that the stain NY79 was Eduardsiella tarda. The challenge tests were carried out by Scophthalmus maximus. with the pure culture of the isolated stain. The symptoms of the artificially infected fish were similar to those infected naturally. The LD50 of per fish was 2.4×104 cfu， it confirmed that Eduardsiella tarda was the pathogeny of the hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. Antibiotic sensitivity test showed that NY79 strain were sensitive to amoxicillin and other 17 kinds of antibiotics， and were resistant to erythromycin and other 4 kinds of antibiotics.

Key words： Scophthalmus maximus； Eduardsiella tarda； artificial infection； antimicrobial susceptibility

大菱鲆（scophthalmus maximus）为鲽形目（Pleuronectifoanes）鲆科（Bothidae）菱鲆属（Scophthalmus）鱼类，原产大西洋东北部区域，因生长迅速，肉质鲜美，营养丰富，深受人们的喜爱。20世纪90年代被引进我国，如今已在我国北方沿海地区形成大规模工厂化养殖[1-2]。伴随着工厂化养殖的发展，大菱鲆的养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，但养殖过程病害频发，其主要原因是养殖水环境恶化以及药物尤其是抗生素的滥用。细菌性疾病是大菱鲆养殖过程中的主要病害之一。其中迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）病最为常见，迟缓爱德华氏菌为兼性需氧革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），爱德华氏菌属（Edwardsiella），该菌是一种重要的条件致病性人畜共患病原菌[3]。该菌的大规模爆发给水产养殖业带来巨大的经济损失，由此菌引起的鱼类传染病具有流行面积广、发病率和死亡率都特别高的特点。该菌引发多种疾病，如鱼类的败血症、腹水病等，它还能引起人类疾病，如脑膜炎、腹膜炎等[4]。

2013年秋季，笔者了解到天津滨海新区某养殖场的大菱鲆成鱼发生死亡，死亡率较高。从病鱼肾脏中分离出了一株优势菌，经人工感染证实了该菌是引起此次病害的病原菌。对该菌生物学性状和16SrRNA等进行研究，确定该菌为迟缓爱德华氏菌，并对该菌进行了药物敏感性试验，研究结果可为天津地区大菱鲆养殖细菌性疾病提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 致病菌的分离

患病大菱鲆采自天津某养殖场，主要症状为鳍条充血，解剖可见脾脏、肾脏等造血器官肿大，疾病暂命名为大菱鲆造血器官肿大病。

选取症状典型的病鱼，通过无菌操作取病鱼的肝、脾、肾组织小块，分别划线接种于2216E、 TSA琼脂和SS培养基，28 ℃培养24～48 h。根据细菌形态学，观察选取优势菌株进行生化鉴定、分子生物学鉴定、回感试验和药敏试验。

1.2 分离菌株理生化鉴定

革兰氏染色：参照染色试剂盒说明书进行，主要步骤为涂片、干燥、固定、染色、镜检。

氧化酶试验：挑取菌落少许，均匀涂抹在氧化酶试纸上，30 s内观察结果，紫色为阳性，无色或者黄色为阴性。

氧化发酵试验：挑取单个菌落分别接种于2支氧化发酵生化管中，其中1支覆盖灭菌液体石蜡，放入（28±1） ℃培养18～24 h后观察结果。若生化管均变为黄色为发酵型细菌。1支未变色，1支变为黄色为氧化型细菌，2支均未变色为非发酵型细菌。

根据革兰氏染色、氧化酶和氧化发酵试验结果，采用ATB系统细菌鉴定系统对菌株进行生化鉴定，参照文献[5-6]判断分离菌株的种类。

1.3 分离菌株分子生物学鉴定

分子生物学鉴定主要采用16s rRNA方法进行，正向引物为27F：5-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3；反向引物1492R：5-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3。由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。50 μL的PCR反应体系： 10×buffer缓冲液5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL， 10 mmol·L-1 dNTP 4 μL， 20 mmol·L-1 27F1 μL，20 mmol·L-11492R 1 μL，5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶0.4 μL，2 μL模板。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，1次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；扩增产物经电泳检测后送金唯智生物科技（北京）有限公司测序。

测序结果通过NCBI中BLAST软件进行在线比对，选取与其相似性最高的细菌16S rRNA基因序列，用MEGA6软件构建系统发育树。选用邻位相连法（Neighbor-joining）获得系统发育树，通过自举分析（Bootstraping）进行系统进化树的评估，自举数据集为1 000次。

1.4 人工感染试验

试验用鱼：大菱鲆全长（10±2） cm，水温为（18±2） ℃，盐度为（28±2）‰，暂养在试验容器为150 L的水槽。

试验分组：试验设3个试验组和1个对照组，每组10尾鱼。先将分离的菌株接种在TSA琼脂培养基28 ℃培养48 h，挑取数个单菌落至无菌生理盐水中配置成菌悬液，调整其浓度分别为3×109，3×108，3×107 cfu·mL-1。每尾鱼腹腔注射0.1 mL菌悬液，对照组则注射等量生理盐水，观察其感染后的发病与死亡情况，计算14 d内的半数致死量。

对人工感染病鱼症状进行观察，与自然发病病鱼症状进行比较；同时，采用与1.1、1.2、1.3相同方法，对人工感染病鱼的病原进行分离鉴定。

1.5 药敏试验

药敏试验主要采用纸片扩散法（K-B法）进行。将细菌接种于MHA平板上于28 ℃培养48 h，挑取数个单菌落制成1.5×108 cfu·mL-1的菌悬液，以灭菌棉拭子蘸取菌悬液分别均匀涂布于MHA平板，自然晾干15 min后，在无菌条件下，再用镊子在酒精灯火焰上灭菌后略停，取药敏纸片（购于杭州微生物试剂有限公司）分别贴于接种了细菌的MHA平板培养基表面，用镊子轻按几下使其贴牢，28 ℃恒温培养48 h后观察抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态特征和生理生化指标

分离菌株（编号NY79）在SS培养基中菌落呈中央黑周边透明的露滴状。镜检细菌为短杆状，无荚，不形成芽袍，革兰氏染色为革兰氏阴性杆菌。氧化酶阴性，氧化发酵为发酵型细菌。经ATB生化鉴定系统 ID32GN试剂条鉴定，菌株NY79为迟缓爱德华氏菌，可信度为99.9%。

2.2 16SrRNA基因序列分析

为了进一步鉴定NY79菌株以及确定它的分类学地位，测定了其16S rRNA基因序列。PCR产物不包括引物结合区，笔者所获得的16S rRNA基因序列有效长度为1 416 bp。将这条16S rRNA基因序列输入国际互联网GenBank中进行检索，发现与该序列相似性最高的100个序列中4个为爱德华氏菌属细菌的 16S rRNA基因序列，相似率均在99%以上，其余相似率都在97%以下。从这100 个序列中选取20个细菌的16S rRNA基因序列进行系统发育学分析，结果如图1所示。NY79 与Edwardsiella tarda EIB202聚成一个分支，序列相似率为99.86%，亲缘关系最为接近。通过生理生化鉴定和16S rRNA基因序列的分析，NY79 鉴定为迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）。

2.3 人工感染试验结果

人工感染试验中，腹腔注射几天后，各感染组陆续出现死亡，观察死亡的大菱鲆其下颌、鳍基部以及腹面皮下充血发红，眼内有积水。解剖发现病鱼鳃丝贫血，肝脏发白，脾脏肿大，肠粘膜充血，与自然状态下患病的大菱鲆表现为临床特征。同时，笔者对人工感染后的大菱鲆进行病原菌分离鉴定，鉴定结果亦为迟缓爱德华氏菌。此试验说明爱德华氏菌为大菱鲆造血器官肿大病的病原。

根据改进的寇氏法[8]计算LD50，由表2可知，得到NY79的每条鱼的LD50为2.4×104 cfu。

2.4 药物敏感试验结果

NY79对24种药物的敏感性测定结果见表3，NY79对阿莫西林、多西环素、氯霉素、头孢氨苄、氟苯尼考、头孢呋辛、头孢他啶、庆大霉素、头孢吡肟、诺氟沙星、氨曲南、环丙沙星、头孢西丁、左氟沙星、头孢噻肟、呋喃唑酮、头孢曲松17种药物敏感；对阿莫西林/克拉维酸、萘啶酸、红霉素、新诺明4种药物耐受。

3 结论与讨论

迟缓爱德华菌最早由Sakazaki和Murata在1959年从蛇（Serpentes）中分离得到。自1962年首次报道该菌感染鱼类（鳗鲡Anguilla japonica）以来，该菌呈世界性分布，在非洲、美洲和亚洲已经有较多报道，可以感染鳗鲡[9-10]、牙鲆（Paralichthys）、大菱鲆[11-12]等20多种食用鱼类。在天津市迟缓爱德华菌引起的疾病已经成为海水养殖鱼类主要病害之一。薛淑霞等[13]研究发现，迟缓爱德华氏菌是大菱鲆和褐牙鲆腹水病的主要病原。笔者也报道了大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌，死亡率在30%左右，病鱼主要症状为鳍条充血，解剖后可见脾脏、肾脏等器官肿大，但笔者未曾发现患病的大菱鲆腹腔有腹水，只是造血器官肿大，这应当引起重视。

目前天津地区大菱鲆的养殖主要以工厂化养殖为主，水产养殖中对大菱鲆细菌性疾病的防治主要还是依靠抗生素，然而抗生素容易导致耐药性的产生[14]，不能很好地预防和治疗疾病，而且抗生素的滥用可能导致水环境污染等一系列问题。本研究中养殖场大菱鲆发病后，多种抗菌药物治疗没有显著效果，药敏试验发现分离的NY79菌株对24种药物中的阿莫西林/克拉维酸、萘啶酸、红霉素、新诺明不敏感，表现出一定的耐药性。因此，根据本试验药敏结果应选用高敏感的药物用于疾病治疗，也可选用两种药物协同使用，以提高药物的使用效果，避免滥用药物。在选择药物时应考虑药物的吸收途径，改进药物投喂技术，选择时针对性要强，减少药物使用量及对环境的影响，这样才能达到理想的治疗效果。

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