植物蛋白质双向电泳样品制备研究进展

陈舒博等

摘 要：蛋白质双向电泳是蛋白质组学的支撑技术，在微生物和动物蛋白质分析上取得较大进展，但在植物蛋白质分析上却进展不大，究其原因在于难以制备到适于双向电泳的植物蛋白质样品。笔者综述了植物蛋白质双向电泳样品制备的方法，分析各种方法的优缺点，并提出今后植物蛋白质样品制备的研究重点。

关键词：蛋白质双向电泳；植物蛋白质样品制备；TCA/丙酮法；酚抽法

中图分类号：Q51 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.002

Abstract： Two-dimensional electrophoresis is the fundamental technology of proteomics， it makes great progress in protein analysis of animals and microbes. However， it makes little progress in protein analysis of plants due to the hardness of the preparation of plant proteins samples suited for two-dimensional electrophoresis. In this paper， methods for the preparation of plant protein's samples were reviewed， merits and drawbacks of these methods were analyzed， and the research focus on the preparation of plant protein's samples in the future was putted forward.

Key words： two-dimensional electrophoresis； preparation of plant protein's samples； TCA acetone precipitation method； phenol method

随着人类基因组框架图的公布和拟南芥等模式生物基因组序列测定的完成，生命科学研究逐渐进入后基因组时代。尽管已有多种植物的基因组被测序，但在这些植物基因组中往往有一半以上基因所表达的功能是未知的。而蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，是揭开基因表达功能的一把金钥匙。直接研究蛋白质的表达模式和功能模式成为生命科学发展的必然趋势。蛋白质组的研究应运而生，而研究蛋白质组的科学则被称为蛋白质组学[1-2]。

由于蛋白质组学是从整体层面研究细胞、组织、器官甚至个体内的蛋白质表达变化，所以需要强有力的方法来分离和显示上千种蛋白质。而蛋白质双向电泳技术具有高分辨率、快速和简单的优点，因而成为蛋白质组学的支撑技术。目前双向电泳技术在微生物和动物蛋白质分析上取得较大进展，但在植物蛋白质分析上往往难以取得比较理想的实验效果，使得植物蛋白质组学研究相对落后于动物和微生物蛋白质组学研究。究其原因，主要是植物组织（尤其是绿色叶片）中含有多酚类、醌、脂类及其他多种次生代谢产物，这些物质一旦存在于植物蛋白质样品中就会严重干扰蛋白分离效果及电泳图谱质量，无法很好地显示出植物中各种蛋白质之间的差异。同时，植物组织中存在的蛋白酶能够水解目的蛋白，降低蛋白质样品的纯度。由此可见，植物蛋白质样品的制备是植物蛋白质双向电泳实验的关键，只有制备到纯度高、杂质少的蛋白质样品才可能获得质量高的电泳图谱。因而有必要归纳和总结适于双向电泳的植物蛋白质样品制备技术，便于研究者根据实际情况选择合适的样品制备方法，获得良好的电泳分离效果和高质量的电泳图谱[3-4]。

1 植物蛋白质样品制备方法

植物蛋白质样品的制备，要准确分析蛋白质样品来源的成分，在维持目的蛋白活性和结构不变的基础上逐步去除无关物质，获取合适的蛋白质样品。在长期的植物蛋白质组研究中，研究者们根据研究的对象和目的，在实验中逐渐摸索，发明并改进了5种常用的样品制备方法。

1.1 TCA/丙酮法

TCA/丙酮法的原理是利用蛋白质在丙酮溶液的疏水条件下变性使蛋白质浓缩并去除污染物。根据谢进等[5]的实验，TCA/丙酮法主要操作步骤是：洗净植物组织，使用液氮速冻，进行低温条件下研磨或超声处理，加入以TCA/丙酮为主要成分的溶液振荡混匀，沉淀过夜，再低温离心去上清，反复操作洗涤沉淀到丙酮溶液无色为止，敞口挥发丙酮，再将沉淀冻存。实验操作应当在低温环境下用尽量短的时间完成，以免蛋白质大量变性。

1.2 酚抽法

酚抽法的原理是利用了蛋白质和脂类溶于酚相而难溶于水相的特性。盐类、核酸、多糖通过溶于水而被去除，脂类通过溶解在乙酸铵甲醇溶液中被去除，再用冷丙酮溶解去除色素和铵离子。操作步骤是：洗净植物组织，使用液氮速冻，进行低温条件下研磨或超声处理成粉末状，转移至离心管内，加入蛋白质提取液振荡混匀，再加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡混匀，低温离心处理，逐步抽取酚相，向酚相加入乙酸铵甲醇溶液低温沉淀过夜，低温离心后获取沉淀。将沉淀用预冷丙酮多次洗涤，敞口使丙酮挥发，将沉淀低温保存[6]。彭存智[7]在运用酚抽法提取红树叶蛋白时将Tris-饱和酚换为酸性的水饱和酚，而刘楠等[8]在运用酚抽法提取蒙古沙冬青根蛋白时将洗涤沉淀的丙酮换为甲醇溶液，也取得预期的实验效果。在使用酚抽法时，应当增加离心力和离心时间，尽可能地把密度大的糖分离至上清液的上层。

1.3 Tris-HCl法

Tris-HCl法的基本原理是利用去污剂SDS破坏疏水键，增加蛋白质的溶解性，而Tris-HCl平衡pH值，防止蛋白质变性。根据曾广娟等[9]和田忠景等[10]的实验，Tris-HCl法的主要操作步骤是：洗净植物组织，使用液氮速冻，进行低温条件下研磨或超声处理成粉末状，转移至离心管内，并加入SDS、甘油和Tris-HCl为主要成分的缓冲液，振荡混匀，低温离心处理后提取上清，加入TCA/丙酮混匀，低温离心后获取沉淀。将沉淀用80%预冷丙酮多次洗涤，室温风干，低温保存。

1.4 Trizol沉淀法

Trizol是一种新型RNA抽提试剂，可以直接从组织中提取RNA。它促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出，通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。根据周雪等[11]和康俊梅等的实验[12]，Trizol沉淀法的主要操作步骤是：洗净植物组织，使用液氮速冻，进行低温条件下研磨或超声处理成粉末状，转移至离心管内，先后按比例加入Trizol和氯仿，振荡混匀，低温离心处理后去除上层水相中的RNA，加入无水乙醇沉淀去除中间层和下层酚相中的DNA和与之结合的高丰度的组蛋白，振荡混匀，低温离心处理后提取上清，先后按比例加入Trizol和异丙醇，振荡混匀，低温离心处理后提取沉淀，沉淀用95%乙醇和无水乙醇洗涤，真空干燥后低温保存。

1.5 尿素-硫脲提取法

尿素-硫脲提取法的基本原理是利用尿素和硫脲破坏疏水键、还原剂DTT破坏二硫键增加蛋白质的溶解性，并使得蛋白酶失活。根据刘伟霞等[13]和王海玲等[14]的实验，尿素-硫脲提取法的主要操作步骤是：洗净植物组织，使用液氮速冻，进行低温条件下研磨或超声处理成粉末状，转移至离心管内，溶于尿素、硫脲、SDS、DTT、Triton-114为主要成分的溶液中，振荡混匀，低温离心处理后提取上清，加入预冷丙酮，低温过夜，离心后收集沉淀，挥发掉丙酮。样本中存在尿素，溶液温度不能超过37°C。

TCA/丙酮法是促使蛋白质在水中沉淀进而分离的方法，属于沉淀类方法；酚抽法和Trizol沉淀法是利用酚类物质萃取蛋白质进而分离的方法，属于萃取类方法；Tris-HCl法和尿素-硫脲提取法是促进蛋白质溶解于水进而分离的方法，属于溶解类方法。

除此以外，Wei等[15]将TCA/丙酮法与酚抽法结合为TCA-丙酮-酚抽法后用于提取蛋白。杨秋玉等[16]提取4种杜鹃叶片蛋白质时就采用TCA-丙酮-酚抽法：即先采用TCA-丙酮法沉淀蛋白，冻干后按照酚抽法的程序萃取蛋白。提取的蛋白质样品再进行双向电泳，获得比较理想的电泳效果。TCA-丙酮-酚抽法兼有沉淀类方法和萃取类方法的特点。

2 植物蛋白质样品制备方法比较

植物组织的蛋白质是动态的，至今没有一种通用的制备方法能将材料中的蛋白全部提取出来。研究目的的不同，是尽可能获得多的蛋白还是仅获得兴趣蛋白，影响了制备方法的选择。但是无论是采用哪种方法，有一点必须做到的是尽可能多地去除核酸、多糖、多酚类、脂类、盐类等杂质，否则会影响蛋白分离效果和电泳图谱质量。不同的研究对象含有的杂质不同，因此也影响了制备方法的选择。

TCA/丙酮法是植物蛋白质样品制备最基本的方法。它的优点是耗时少、容易操作，减少了蛋白酶的修饰作用，蛋白质粗提物产量大，一般作为植物蛋白提取的初始方案。缺点是蛋白质容易变性，很难重新溶解，对一些植物组织中多酚类物质的去除能力有限，因而可以加入适量的吸附剂PVPP或PVP对TCA/丙酮法进行改良。刘国勇等[17]的实验证实不溶于水的PVPP去除酚、醌类物质的效果比可溶于水的PVP好。

酚抽法的优点是能够去除大量干扰物质，获得相对较多的低分子量蛋白。在植物组织含有大量易水解的多糖或易溶于水的盐类时如海滨木槿和枇杷叶片组织[18-19]，酚抽法能够将其顺利引入水相而去除。特别是含有大量多酚类、多糖和色素等次生代谢产物的顽拗植物组织，在蛋白分离效果方面酚抽法比TCA/丙酮法优势明显。缺点是操作复杂耗时，Tris-饱和酚具有一定的毒性，易对环境造成污染。

Tris-HCl法的特点是加入SDS以增强蛋白质的溶解性，Tris-HCl缓冲液平衡pH值，远离各种氨基酸溶解度最小的等电点，因而其优点是能够分离出酸性蛋白、极高极低分子量蛋白，在疏水性蛋白的提取方面也有所改善，缺点是缓冲液需要密封保存。

Trizol沉淀法的特点是使用能够分离DNA和RNA的Trizol试剂，因而优点是能够去除大量干扰物质如DNA、RNA和高丰度组蛋白Rubisco。缺点是操作较为复杂，耗时耗力，成本较高。Trizol沉淀法用得比较少，一般用于植物叶片和幼苗的蛋白质提取，如野牛草叶片、紫花苜蓿幼苗和黄花苜蓿幼苗[12，20-21]。

尿素-硫脲提取法的优点是对低分子量蛋白质分辨效果较好，价格低廉，操作简便。缺点是在电泳中能够检测到的蛋白质斑点较少，对多酚类、色素、盐类等干扰物质的去除能力不够。从文献中来看，尿素-硫脲提取法用得比较少。

TCA-丙酮-酚抽法则将TCA-丙酮沉淀法和酚抽法融合在一起，去除引起样品溶液黏稠的多糖和核酸效果较好，在样品溶液过于黏稠时相比于酚抽法具有一定的优势[16]。但该法也存在着操作繁琐、蛋白损失较大的缺点。此方法在拟南芥叶片、非洲山毛豆叶片、银杏小孢子叶球[22-24]等很多植物蛋白的提取中均取得了较好效果。

3 结论与展望

到目前为止，适于双向电泳的植物蛋白质样品制备方法总共有6种，它们分别是：TCA/丙酮法、酚抽法、Tris-HCl法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法、TCA-丙酮-酚抽法：TCA/丙酮法是最基本、应用最为广泛的方法，蛋白质粗提量大，加入PVPP可以去除多酚类；酚抽法适合于含有大量多糖、盐类等次生代谢产物的植物蛋白质样品提取；Tris-HCl法能够分离出酸性蛋白和极高极低分子量蛋白；Trizol沉淀法适合于含有大量高丰度组蛋白Rubisco的植物叶片和幼苗的蛋白质提取；尿素-硫脲提取法能够分离出低分子量蛋白且操作简便；TCA-丙酮-酚抽法去除引起样品溶液黏稠的多糖和核酸效果较好。

在现在的植物蛋白质双向电泳的实验中，研究者往往需要同时运用多种方法进行样品制备并进行比较。希望在日后的研究中，研究者能够在前人研究的基础上，依据样品自身的特性次生代谢物成分和研究目的总结归纳各种方法的适用范围，做到具体问题具体分析，摸索优化出适合各种植物组织蛋白质样品制备的实验方案，加快植物蛋白质组学发展，更好地服务于生命科学研究。

参考文献：

[1] 阮松林，马华升.植物蛋白质组学[M].北京：中国农业出版社，2009：1-13.

[2] 夏其昌，曾嵘.蛋白质化学与蛋白质组学[M].北京：科学出版社，2004：233-304.

[3] 何瑞锋，丁毅，张剑锋，等.植物叶片蛋白质双向电泳技术的改进与优化[J].遗传，2000，22（5）：319-321.

[4] Canovas F M，Dumas-Gaudot E，Recorbet G，et al. Plant proteome analysis[J].Proteomics，2004（4）：285-298.

[5] 谢进，田晓明，刘淑欣，等.适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法[J].北京林业大学学报， 2013，35（4）：144-148.

[6] 陈晶瑜，郭宝峰，何付丽，等.适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较[J].中国农学通报，2010，26（23）：97-100.

[7] 彭存智，李蕾，刘志昕.红树叶蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析[J].热带生物学报，2010，1（1）：12-16.

[8] 刘楠，高飞，周宜君，等.蒙古沙冬青根蛋白的提取及双向电泳体系的建立[J].北京师范大学学报：自然科学版，2013，49（4）：365-368.

[9] 曾广娟，李春敏，张新忠，等.苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较[J].中国农学通报，2008，24（8）：105-108.

[10] 田忠景，康美玲，王秀文.石榴叶片蛋白提取方法研究[J].北方园艺，2012（19）：137-139.

[11] 周雪，冯辉，冀瑞琴.适合双向电泳的大白菜花蕾蛋白提取及浓度测定方法[J].分子植物育种，2013，11（2）：249-254.

[12] 康俊梅，熊军波，孙彦，等.利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究[J].西北农业学报，2010，19（2）：29-34.

[13] 刘伟霞，潘映红.适用于小麦叶片蛋白质组分析的样品制备方法[J].中国农业科学，2007，40（10）：2 169-2 176.

[14] 王海玲，池旭娟，阚雪芹，等.桑椹与叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较试验[J].蚕业科学，2009，35（4）：847-850.

[15] Wei W，Rita V，Monica，et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis，2006（27）：2 782-2 786.

[16] 杨秋玉，耿兴敏，彭方仁.杜鹃叶片3种蛋白质提取方法的比较[J].安徽农业大学学报，2014，41（3）：440-444.

[17] 刘国勇，梁宏伟，陈发菊.巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取与双向电泳分离[J].江西农业大学学报，2009，31（3）：393-396.

[18] 李翠云，姜彦成，乔桂荣，等.海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立[J].西南林业大学学报，2012，32（4）：30-35.

[19] 马斌，孙骏威，余初浪，等.枇杷叶片和果实总蛋白质提取及双向电泳的优化方法[J].果树学报，2011，28（2）：358-362.

[20] 熊军波.紫花苜蓿响应盐胁迫的蛋白质组研究[D].北京：中国农业科学院，2011.

[21] 王楠.低温胁迫下黄花苜蓿蛋白质组的初步分析[D].北京：中国农业科学院，2008.

[22] Maldonado A M， Echevarría-Zome O S， Baptiste S J，et al. Evaluation of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresis[J].Journal of Protemics，2008（71）：461-472.

[23] 赖多，徐汉虹.非洲山毛豆叶片蛋白组双向电泳样品制备方法的建立[J].生物技术通报，2010（4）：103-107.

[24] 杨妮娜，崔彬彬，孙宇涵，等.银杏小孢子叶球蛋白提取和双向电泳体系优化（Ⅱ）[J].东北林业大学学报，2011，39（8）：55-57.